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作为中枢神经系统（Central Nervous System，CNS）的固有免疫细胞，小胶质细胞（Microglia）在健康CNS中发挥着重要的免疫、监测和保护作用【1】。有证据表明，小胶质细胞来源于卵黄囊组织中的红髓系前体细胞【2】，它们迁移、定植、分化，并在大脑中成熟，最终达到稳定状态，维持中枢神经系统环境的免疫平衡【3】。与成年成熟的小胶质细胞相比，胚胎期小胶质细胞表现出很大的异质性，并参与各种生理活动的调节。中枢神经系统脑包含的主要脑区有大脑皮层、间脑、中脑和小脑，目前对于起源于卵黄囊组织中红髓系前体细胞的小胶质细胞在四个脑区的发育路径和不同状态转换，以及它们的相关功能特征尚不清楚。
近年来，快速发展的单细胞组学技术，为理解细胞命运决定和细胞异质性提供了强有力的工具。之前对小鼠的单细胞测序研究结果显示，小胶质细胞具有高度异质性【4】。然而，人类和小鼠之间的物种差异极大地限制了我们对人类小胶质细胞分化和发育功能的理解，尤其是在早期胚胎发育期间，对于人脑早期发育过程中小胶质细胞的区域特化命运决定和状态转换并不清楚。
2022年 3月 3日，中国科学院动物研究所焦建伟研究组、北京大学杜鹏研究组、中国科学院动物研究所王雁玲研究组、北京大学靳蕾研究组合作在Cell Stem Cell 杂志在线发表了题为Decoding the Temporal and Regional Specification of Microglia in the Developing Human Brain的文章。该研究首次解析了人脑发育中不同区域的小胶质细胞单细胞转录组，精准揭示了发育中人脑小胶质细胞区域特化和状态转换的时空动力学特征，并通过比较小鼠和人类皮层小胶质细胞转录组差异，评估了这两个物种之间状态转换的保守性和分子差异性。
1. 构建人胚胎脑不同区域小胶质细胞的单细胞转录组图谱
利用10x Genomics单细胞测序技术，作者绘制了来自人类胚胎，包括Carnegie Stage (CS) 12卵黄囊和头部组织以及不同脑区包括大脑、间脑、中脑、小脑在多个孕周（gastrulation week，GW）（GW8、GW10、GW12、GW16和GW23）的单细胞转录组图谱。在进行质量控制和生物信息学聚类分析后，作者选择CD45+CD33+髓系细胞（共12565个细胞）进行分析。基于已知标记基因，该项研究识别了20个小胶质细胞亚群。同时，根据基因表达特征将这些亚群分成了起源、增殖、免疫应答和神经元基因富集相关四大类。2. 鉴定出小胶质细胞发育2条重要分枝：神经元基因富集分枝和免疫相关分枝为了可视化和重塑来自CS12同一群原始髓系前体细胞的神经元基因富集小胶质细胞和免疫相关小胶质细胞的细胞命运决定轨迹，作者使用Monocle2和URD进行伪时间分析。有趣的是，两种分析方法均显示出类似的结果：源自CS12卵黄囊和头部的小胶质祖细胞首先启动细胞增殖，在不同的细胞周期阶段成为增殖的小胶质细胞，然后这些增殖的小胶质细胞向两种不同的细胞命运过渡：免疫或神经元基因富集特征。对于免疫相关的发育分枝，小胶质细胞通过一个共同的中间阶段，最终在GW23达到区域特化。然而，具有不同区域特征的神经元基因富集小胶质细胞可以直接从增殖的细胞分化而来。这是首次揭示了人胚胎脑神经元基因富集的小胶质细胞命运分枝。3. 神经元基因富集小胶质细胞很早出现并出现区域特化在这项研究中，作者鉴定出7群富含神经元基因的小胶质细胞，均出现在包括大脑、间脑、中脑和小脑的四个不同区域。具体而言，在GW8检测到大脑特异性的Cluster 7 (C7) 和中脑/小脑特异性的C8，并在GW16显著累积。中脑特异性C5和C14分别主要在GW10和GW12时观察到，而间脑/大脑特异性C4仅在GW23时观察到。相比之下，C16没有明显的区域特异性，可以在所有四个区域检测到。在大约GW10时检测到小脑/中脑特异性C15，且在GW12后显著增加。综上所述，此项研究结果表明，富含神经元基因的区域特异的小胶质细胞早在GW8（CNS区域形成的时期）时就在早期脑发育的不同阶段出现，同时也提示在早期脑发育的不同阶段该类小胶质细胞可能行使特定的功能。4. 免疫相关小胶质细胞在区域特化的发育中会脱离相对静息状态，转换成多种激活状态稳态指小胶质细胞的一种静息状态，脱离静息状态会导致多种免疫应答反应的激活。有趣的是，最近的一项研究描述了发育中人类胚胎CNS中类似稳态的平衡状态【6】。在此，作者分析了胎儿小胶质细胞的区域特异性和状态转换之间的潜在联系。结果显示，CS12的原始小胶质细胞前体细胞并没有高度表达典型的稳态基因。从GW8至GW16，增殖和免疫相关小胶质细胞通过表达上述稳态基因开始建立相对稳定状态。然而，典型的成熟稳态基因SLC2A5仍沉默表达，表明这些小胶质细胞进入了与之前报道的类似的胎儿静息状态。非常惊人且出人意料的是，到GW23时，所有区域特异性免疫相关小胶质细胞，包括大脑/小脑特异性的C18，以及间脑特异性的C19和C20，上述静息基因的表达显著下调，最终退出胎儿相对静息状态。此研究首次提出免疫相关小胶质细胞的区域特化与小胶质细胞静息状态的退出相关联。接下来，作者进一步了解GW23区域特化胎儿小胶质细胞的不同免疫激活状态。有趣的是，与在健康大脑成年小胶质细胞中活跃高表达基因的模式不同，区域特化的免疫相关小胶质细胞（包括C18-1、C18-2、C19和C20）均高度富集了在阿尔茨海默病小胶质细胞中发现的与激活和吞噬相关的基因，如AOPE等。引人注目的是，典型的稳态相关基因SLC2A5虽然在GW8和GW16之间的早期胎儿阶段沉默表达，其在区域特化胚胎小胶质细胞中却被显著激活。上述研究结果概述了具有区域特异性的免疫相关小胶质细胞在胎儿期激活的独特特征，这与之前报道的成人成熟小胶质细胞明显不同。接下来，作者比较了人类和小鼠的小胶质细胞静息状态转变。正如之前阐述，人类小胶质细胞通过激活CX3CR1、TMEM119和P2RY12/13的表达，在GW8开始获得类似稳态特征，而当典型的小胶质细胞激活基因（如APOE、CD68和SPP1）被诱导时，这些稳态相关基因在GW23被沉默，代表人类胚胎静止/活跃状态的转变。在小鼠中，这些静息相关基因的诱导主要发生在E13.5。从P2开始（小鼠出生后）观察到这些基因的表达减少，导致激活期出现。值得注意的是，这些典型的静息基因在成年小鼠（P20）中被重新激活到更高的水平，这表明胎儿小胶质细胞的静息状态与成人体内平衡非常不同。上述比较揭示了胎儿小胶质细胞的动态静息/活动状态转换在人类和小鼠中是保守的。将人鼠小胶质细胞拟合后，作者发现大多数其他细胞类型可以合并在一起，表明人类和小鼠的几种细胞类型和发育途径是保守的。此外，通过分析差异表达基因，发现人和小鼠小胶质细胞的分子特征存在一些差异。首先是物种特异性基因的表达。人类共有139个高表达基因，而在小鼠中有98个高度富集的基因。另外，人鼠在特定亚群还存在一些差异表达基因。综上所述，这项研究揭示了人类胚胎小胶质细胞从卵黄囊到脑不同区域的整体发育路径、区域异质性、胎儿小胶质细胞状态转变的独特特征，以及早期大脑发育期间状态转变和区域特异性之间的密切联系，这些发现将为小胶质细胞相关疾病的发病和病理生理机制研究提供重要的理论基础和数据库资源。焦建伟、杜鹏、王雁玲和靳蕾为该论文的共同通讯作者。博士后李妍昕、博士后李忠秋、博士研究生杨敏、博士后王飞扬、张玥红主任医师、李蓉主任医师为该论文的共同第一作者。滕兆乾研究团队参与了项目协作。温子龙（香港科技大学生命科学部）
小胶质细胞作为脑实质中唯一常驻的免疫细胞，在脑部稳态维持以及脑部疾病例如神经退行性疾病，神经炎症中均发挥重要作用。而近些年的研究表明小胶质细胞在脑发育过程中也发挥着重要作用。它可以在早期胚胎脑发育期间调控神经干细胞的增殖与分化，突触的形成与修剪，胶质发生，血管发生等过程。小胶质细胞的发育缺陷与许多脑部疾病相关，像神经发育障碍相关疾病以及神经退行性相关疾病，如自闭症，精神分裂症，抑郁症以及阿尔茨海默症等。小胶质细胞与其它神经元与神经胶质细胞不同，小胶质细胞来源于卵黄囊的原始巨噬细胞，其通过早期血液循环迁移并且定植于脑部，随着神经发生的进行逐步有规律的分布于脑中。尽管已经有报道人胚胎期CNS小胶质细胞存在异质性，但是这些异质性的小胶质细胞是否在脑中存在空间异质性？这些空间异质性的小胶质细胞又在早期脑发育过程中发挥了什么作用？调控这些异质性小胶质细胞发育的分子基础又是什么呢？阐明这些异质性的小胶质细胞，将有助于开发出一些新的治疗脑部疾病的方法。而受实验材料、方法等诸多因素的限制，对人脑小胶质细胞的发育的区域异质性研究还非常有限，无法有效的揭示小胶质细胞在不同脑部区域的异质性和差异功能。近日，来自中国科学院动物研究所焦建伟研究组、北京大学杜鹏研究组、中国科学院动物研究所王雁玲研究组、北京大学靳蕾研究组合作在人类小胶质细胞发育研究领域取得重要发现，四个课题组共同在Cell Stem Cell杂志发表题为Decoding the Temporal and Regional Specification of Microglia in the Developing Human Brain的论文。在该项研究中作者利用10x单细胞转录组测序技术以及体外人胚胎干细胞诱导分化等技术方法对小胶质细胞在人类胚胎不同阶段、不同脑区中的时空发育特化进行了精细的研究。作者揭示了小胶质细胞从卵黄囊到不同脑部区域的整体发育路径，发现了小胶质细胞在人类发育的不同脑区存在区域特异的亚群。同时作者还发现除了存在免疫特性分支的小胶质细胞，还发现了一类神经基因富集的小胶质细胞亚群，而这些亚群同样存在脑区特异性，并且很早就出现了区域特化。这两类小胶质细胞的发现同时也引申出一系列有趣且十分重要的问题，例如：免疫和神经相关亚群在人胚胎发育过程中的具体功能是什么？这两个亚群小胶质细胞在生理或病理情况下是否能相互转变？以及成年时期相关神经系统疾病的发生是否和这两类小胶质细胞亚群的失衡有关？此外，作者还发现小胶质细胞在区域特化发育过程中会由相对静息的状态转变为多种激活状态，而这些激活状态与小胶质细胞在这些脑部不同区域发挥的不同功能密切相关。最后，作者发现了这种激活状态变化具有人鼠保守性，同时还鉴定出人鼠小胶质细胞的分子差异性。该研究跨越人脑发育的多个阶段，覆盖多个脑部区域，是目前为止对人体胚胎脑部小胶质细胞区域异质性最系统且完整的研究，为相关领域的研究提供了目前最可靠的人胚胎不同脑区小胶质细胞的转录组数据。该研究的结果表明人体胚胎小胶质细胞的发育存在显著的区域异质性，同时在发育中存在状态转变，这些转变与其发挥的区域特异性功能相关。并且该情况与在小鼠中非常相似，为小鼠小胶质细胞研究结果向人体医疗转化提供了理论依据。作为一个里程碑式的工作，该研究将为人体小胶质细胞的研究奠定坚实有力的基础。
原文链接：
https://doi.org/10.1016/j.stem.2022.02.004
1. Salter, M.W., and Beggs, S. (2014). Sublime microglia: expanding roles for the guardians of the CNS. Cell 158, 15-24.
2. Ginhoux, F., and Guilliams, M. (2016). Tissue-Resident Macrophage Ontogeny and Homeostasis. Immunity 44, 439-449.
3. Prinz, M., Erny, D., and Hagemeyer, N. (2017). Ontogeny and homeostasis of CNS myeloid cells. Nature immunology 18, 385-392.
4. Hammond, T.R., Dufort, C., Dissing-Olesen, L., Giera, S., Young, A., Wysoker, A., Walker, A.J., Gergits, F., Segel, M., Nemesh, J., et al. (2019). Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes. Immunity 50, 253-271.e256.
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