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​Science | 揭开“圣杯”面纱：Hoelz团队两文解析核孔复合物多个精细构象

BioArt BioArt 2023-04-30
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Science专刊丨冷冻电镜+AlphaFold联用揭开“圣杯“面纱——5篇论文关注核孔复合体精细结构解析
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真核细胞具有亚细胞区室化的特征，并在各亚细胞区室选择性地转运折叠蛋白质和蛋白质/核酸复合物。细胞核与细胞质之间被核膜分离，而核质之间的物质转换是通过核孔实现的。核孔是由内外核膜融合处形成的环状开口，其中嵌有核孔复合物 (nuclear pore complex, NPC)。核孔复合物是核质转运的唯一双向通道。人类核孔复合物是一种大型的蛋白复合物，由约34种不同的核孔蛋白 (nucleoporins, nups) 以多拷贝形式构成，其总蛋白质构成数目约为1000多个，外径约 120 nm，高约75 nm，分子量约为110 MDa。核孔复合物具有一个对称核心 (symmetric core)，其由环绕中央运输通道的内环 (inner ring) 和锚定在核膜两侧的Y型包被核孔蛋白复合物 (coat nucleoporin complex, CNC) 形成的双外环构成。核孔复合物对称中心的外环镶嵌了不具对称性的胞质纤丝 (cytoplasmic filaments) 和核篮 (nuclear basket)。它们不仅建立了核孔复合物的运输方向性，并且为运输因子以及小的Ran-GTPase提供了结合位点。另外，核孔复合物胞质纤丝的核孔蛋白在信使核糖蛋白颗粒 (mRNP) 离开核孔复合物中央运输通道时的不可逆重塑中也发挥重要作用。因此，核孔复合物的胞质面 (cytoplasmic face) 是疾病相关突变的热点区域，通常也是病毒因子的靶点。

早前的研究通过生物化学重构，阐明了对称核心的核孔蛋白之间的相互作用网络；通过核孔蛋白和核孔蛋白复合物的晶体和单颗粒冷冻电镜 (Single particle Cryo-EM) 结构解析，揭示了它们的三维形状和蛋白相互作用的分子细节；通过将解析蛋白结构对接到冷冻电子断层扫描 (cryo-ET) 重构的人类核孔复合物中，揭示核孔蛋白的化学计量和定位；以及基于细胞生物学的分析，验证生物化学和结构发现的生理相关性。结合这些方法，此研究建立了人类核孔复合物对称核心的近原子的复合结构。此外，最近对来自不同物种的核孔复合物进行原位cryoET重建表明，核孔复合物的内环能够响应核膜张力的变化并进行可逆地收缩和扩张，从而将中央运输通道的直径调节约20 nm。研究表明内环的连接核孔蛋白 (linker nups) 可以为核孔复合物提供凝聚力，使其能够承受如此大规模的构象变化，但是其中分子机理尚不清楚。


加州理工学院的André Hoelz研究团队，结合生物化学重构，高分辨率晶体和单颗粒冷冻电镜结构解析，人类核孔复合物的冷冻电子断层扫描重构对接 (docking) 和生理性实验验证，揭示了人类核孔复合物的胞质面的近原子结构以及内环连接-支架(linker-scaffold)核孔蛋白的相互作用网络。


在Petrovic等人的研究中，作者对所有的真菌以及人类内环支架核孔蛋白的连接蛋白结合位点进行了分析，同时解析了相应的连接-支架复合物的晶体和单颗粒冷冻电镜结构。作者完成了对所有连接-支架核孔蛋白相互作用的生化表征，结果表明这些核孔蛋白相互作用存在相当大的序列差异，但是它们进化上具有保守性。与此同时，作者解析了一系列结合了Nic96、Nup145N和Nup53连接核孔蛋白的完整支架核孔蛋白Nup188和Nup192的晶体和单颗粒冷冻电镜结构，结构显示Nup188和Nup192 形成明显的问号型构象，是两个进化上保守的异八聚体内环复合物的基石。连接核孔蛋白通过短序列的基序 (motif) 与支架核孔蛋白表面的口袋结合，同时其侧翼区域通常含有分散的额外相互作用位点，加强了与支架蛋白的结合。作者在酿酒酵母 (S. cerevisiae) 细胞内采用结构指导的功能分析，证实了连接-支架核孔蛋白相互作用的稳定性，而且也确定了文章中生化和结构发现的生理相关性。作者将实验解析的所有结构分别对接到收缩以及扩张的人类和酵母核孔复合物cryo-ET重构图中，建立了一个近原子的核孔复合物对称核心的复合结构。这个近原子结构表明了Nup188和Nup192复合物在完整真菌和人类核孔复合物的定位差异，同时也揭示了连接-支架核孔蛋白相互作用网络的拓扑结构。连接-支架核孔蛋白复合物产生八个相对刚性的内环辐条 (spoke)，相邻辐条之间可以灵活相互连接，因此形成横向通道。细胞核膜蛋白可以通过这些通道在核膜的外膜和内膜之间运输。有趣的是，连接-支架相互作用在外环中发挥相反地作用，其在八个核辐条和细胞质外环辐条之间形成紧密的交联，从而限制了内环的扩张运动。


在Bley、Nie 、Mobbs、 Petrovic、 Gres、 Liu等人的研究中，作者阐明了人类和嗜热梭菌 (C. thermophilum) 胞质纤丝核孔蛋白的蛋白-蛋白和蛋白-RNA相互作用网络，揭示了核孔复合物的胞质纤丝核孔蛋白复合物 (cytoplasmic filament nucleoporin complex, CFNC) 是由一个异质三聚体的曲卷螺旋中心 (coiled-coil hub)，将两个独立的mRNA重塑复合物连接一起，从而形成地进化上保守的异质六聚体。经过一系列的生化实验和晶体结构解析，文章显示只存在于后生动物细胞的胞质纤丝核孔蛋白NUP358，是由16个不同的结构域组成，其包括一个N末端S型alpha螺旋结构域，一个曲卷螺旋的寡聚化元件，数个Ran结合结构域，一个E3连接酶结构域以及一个C端脯酰胺异构酶结构域。作者将实验解析的晶体结构对接到人类核孔复合物cryoET重构图中，并进行了生理性验证，揭示了通过曲卷螺旋的寡聚元件连接而形成五聚体的NUP358，通过其N末端结构域锚定在包被核孔蛋白复合物的中央茎区域，能够将其余的柔软连接的结构域伸展至细胞质约6 nm。


基于细胞生物学的分析，他们证明在细胞间期NUP358不仅不影响已组装的核孔复合物的结构完整性，也不妨碍mRNA的输出，不过其对于细胞高效蛋白翻译是必需的。作者在确定了NUP358在人类核孔复合物的cryoET重构图位置后，发现人类核孔复合物的胞质面靠近外环核孔蛋白NUP93的位置剩余了一个4字型的电子密度，而这个密度正好与CFNC曲卷螺旋中心的尺寸相匹配。早前的研究表明NUP93在N端具有一个组装传感器，能够将核孔通道蛋白 (channel nucleoporin heterotrimer, CNT) 的曲卷螺旋中心锚定在内环上，作者通过生化重构实验证实该NUP93组装传感器同时能够将CFNC锚定在人类核孔复合物的胞质面。与此不同，嗜热梭菌的CFNC则具有不同的锚定机制，两个不同的CFNC将分别结合在两个不同的包被核孔蛋白 (CNC) 的非结构化的组装传感器上。作者于此也对比了核面跟胞质面的密度，发现在核面，可用于结合胞质核孔蛋白NUP358和CFNC的位点被占据，而在胞质面，核篮组件ELYS等效位置却未被占据，这一发现表明存在除空间竞争以外的作用机制来促进核孔蛋白的不对称分布。

综合来说，这两篇论文完成了20多年来人们对解析人类核孔复合物结构的需求，确定了其约2000万个原子的精确定位。除了对核孔复合物结构和功能重要地直接的见解，该研究同时为未来旨在探究mRNA输出、核孔复合物组装、病毒因子干扰以及核孔蛋白疾病等分子机理的研究提供了丰富的基础。此种跨学科的研究方法也可以作为解析其余类似的大型复杂、处于结构生物学主要前沿的分子细胞机器结构的模式。

原文链接：
1. https://doi.org/10.1126/science.abm9129
2. https://doi.org/10.1126/science.abm9798

制版人：十一

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