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Angew: AuNPs/DNA系统高效高选择性递送抗癌药物

广州萃英化学 化学加 2021-06-12
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#Angew
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导读

福州大学吴再生教授团队和McMaster大学李应福教授团队设计编辑CDT序列，使RPs可以自我折叠成一个DNA装配体，并将RDL进一步与金纳米粒子和阿霉素结合生成复合纳米材料，可有效地被癌细胞内化，并实现荧光成像追踪。此纳米复合物具有设计简单、载药量高、选择性细胞靶向和pH响应性药物释放等优点。相关成果发表在Angew. Chem. Int. Ed.上。（DOI: 10.1002/anie.202005624）

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阿霉素（DOX），是一种广泛使用的抗癌药物，可在DNA序列中插入G-C碱基对，通过抑制DNA的复制来诱导细胞凋亡。金纳米粒子（AuNPs）具有优异的光学和电子性能、良好的生物相容性和易于功能修饰等优点。有研究显示球形核酸（SNAs）（AuNPs为核心+定向合成的DNA寡核苷酸外壳）能够被细胞高效快速内吞，并且具有极好的稳定性。由于DOX与DNA的结合能力，可使用以DNA为外壳的AuNPs作为载体将DOX高效地递送到癌细胞。许多复杂的DNA是以大量人工合成的短链寡核苷酸为主要原料，通过程序化折叠而形成的。然而，长DNA模板的构建和大量短链DNA的人工合成耗时耗力。滚环扩增（RCA）是用特殊DNA聚合酶复制一个环状DNA模板（CDT），继而产生具有重复序列的长单链DNA产物的生物化学过程。和传统的方法相比，RCA产物（RPs）更容易获得，大大简化了复杂DNA的人工合成过程。作者精心设计CDT的序列，使RPs可以自我折叠成一个DNA装配体（“DNA晶格带”（RDL））。RPs的合成过程如Figure 1a。RPs中包含能够创建3个单元内（iuDP 1，2，3）和2个单元间（buDP1，2）复合体的重复序列，这些复合体通过配对相互作用使多个RPs形成一条DNA纳米条纹带（Figure 1b，RDL1）。在RDL1的每个自折叠单元中，有6个未配对核苷酸，包括一侧的3个5'-CGCTA-3'和另一侧的3个5'-GTATA-3'。用DNA寡核苷酸链5'-TAGCGTAGCGTAGCG-3'（SS1）和5'-TATACTATACTATAC-3' （SS2），将这些未配对单链转换成额外的双链，即RDL2的修饰带（Figure 1c）。AFM图像清楚地显示了RDL1和RDL2的带状配置（Figure 2）。RDL1和RDL2的高度约为1.1 nm，与单层DNA双螺旋结构的预测高度一致。AFM的放大图像显示出RDL2与所预测的晶格带状结构一致（Figure 3）。 ▲Figure 1. DNA晶格带（RDL）合成示意图。a. 通过滚环扩增（RCA）自折叠长链DNA b.和c.分别描述了RDL1和RDL2的结构  注意:phi29 DP= phi29 DNA聚合酶（图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.）▲Figure 2. AFM图表征RDL1和RDL2  a-f.RDL1和RDL2的AFM图像，图像大小分别为5×5 （a和d）、3×3 （b和e）、1×1 （c和f）μm2  g-h. RDL1（g）和RDL2（h）分别沿着c和f指示线的横截面分析，平均宽度（AW）和平均身高（AH）分别来自于RDL1或RDL2 （n = 10）（图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.）▲Figure 3. 放大RDL2的AFM图像 将图2f所示的AFM图像放大10倍（中）和20倍（右），RDL2的观测特征与预测的网格带状结构一致（图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.）通过直接在AuNPs表面进行RCA反应，制备出以AuNP为核、DNA为外壳的球形纳米组装体（Au-RDL2）（Figure 4a）。在DNA外壳上连接细胞靶向DNA适配体（AS1411，一种专门识别在癌细胞表面过度表达的核仁素的DNA适配体），制备的Au-RDL2-AS1411组装成为Au-R2A。此纳米组装体可实现癌细胞靶向。AFM图像显示了Au-R2A独特的结构配置（Figure 4b），其高度为20 nm，宽度为210 nm（Figure 4c and 4d）。37 ℃新鲜小鼠血清孵育Au-R2A（用FAM（荧光标记物）标记SS2），孵育0-24 h，然后用琼脂糖凝胶分析，测定Au-R2A的核酸酶抗性。结果显示DNA外壳对核酸酶的消化有很强的抵抗力（Figure 5）。▲Figure 4. a. Au-RDL2-DOX和Au-R2A-DOX的制作说明  b.Au-R2A的AFM图像  c.Au-R2A的截面分析  d. Au-R2A的3D AFM图像和相应的尺寸分析（图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.）▲Figure 5. 琼脂糖凝胶电泳（1%）分析Au-R2A的血清稳定性，Au-R2A在37 ℃新鲜小鼠血清中保存不同时间（图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.）将Au-R2A（RDL2、Au-tT1、RDL2-AS1411和RDL2作对比）和2 mM DOX作用24 h后，离心分离负载DOX的Au-R2A（RDL2、Au-tT1、RDL2-AS1411和RDL2作对比）。Au-tT1未观察到DOX负载。DOX较多负载到RDL2、RDL2-AS1411、 Au-RDL2和Au-R2A上（试管中红色沉淀的出现，这是由于DOX负载后，DNA的溶解度降低）。上清的红色较浅，说明Au-RDL2和Au-R2A负载的DOX较多（Figure 6a）。为定量评价Au-R2A的负载能力，测Au-R2A上清的吸收光谱，得到在480 nm处的光密度（DOX的最大吸附量）（Figure 6b）。结果表明，Au-R2A显示出优异的DOX装载能力。▲Figure 6．a.拍摄六种不同溶液的图像，比较评价Au-R2A的药物载荷能力（含DOX（2 mM）的溶液中孵育24 h）  b.上清的吸光度（将Au-R2A纳米颗粒与DOX （2 mM）孵育24 h，离心后，将上清液稀释4倍，进行UV-vis吸收测定）（图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.）在模拟生理条件（PBS，pH 7.4）和类似于癌细胞的酸性微环境（乙酸缓冲液，pH 5.2）下，研究Au-R2A-DOX的体外释放行为。如图Figure 7所示表明，酸性环境更有利于Au-R2A释放DOX。▲Figure 7. Au-R2A-DOX在不同pH值下DOX的体外释放动力学，误差条表示平均值±SD（n = 3）（图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.）用MCF-7细胞检测癌细胞对Au-R2A-DOX的内化能力。共聚焦显微镜分析显示，MCF-7细胞用Au-R2A-DOX处理时DOX的红色荧光比用其他方式处理（control，RDL2-DOX，RDL2-AS1411-DOX，Au-RDL2-DOX）的要高得多（Figure 8a and 8b），研究结果表明MCF-7细胞对Au-R2A的内化能力较高。将MCF-7细胞经SS1-AS1411预处理，阻断细胞表面部分核仁素，然后用Au-R2A-DOX处理（Figure 9a）。在共聚焦显微镜下观察到未阻断细胞的红色荧光远高于预阻断细胞（Figure 9b）。流式细胞术分析显示，预阻断细胞的荧光强度要低得多（Figure 9c）。说明AS1411与细胞表面核仁素的相互作用促进了Au-R2A穿过细胞膜。▲Figure 8. Au-R2A在靶向给药和肿瘤治疗中的应用  a.MCF-7在DMEM中培养2 h的共聚焦荧光图像（control，RDL2-DOX，RDL2-AS1411-DOX，Au-RDL2-DOX，Au-R2A-DOX），阿霉素的最终浓度是40 µM  b.从a得到的DOX荧光强度（强度根据细胞数量归一化，误差条表示平均值±SD （n = 5），RFU:相对荧光单位 ） c.在含有不同成分的培养基中培养24 h后MCF-7的细胞存活率（阿霉素的当量浓度为134 µM，误差条表示平均值±SD （n = 5））（图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.）▲Figure 9. 受体介导的Au-R2A内化  a.有或无特定膜受体阻断适配体SS1-AS1411时Au-R2A的细胞内化示意图  b.共聚焦成像证实膜受体介导Au-R2A内化到正常的MCF-7细胞中  c.流式细胞分析证实膜受体介导的Au-R2A内化进入靶细胞“+ SS1-AS1411”表示MCF-7细胞经预阻断孵化（0.6 μM SS1-AS1411，0.5 h）（图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.）总结：作者设计证明了自折叠RCA产物可以构建致密的DNA纳米条纹带，通过直接在AuNPs表面进行RCA反应，制备出以AuNP为核、DNA为带壳的球形纳米组装体。在DNA外壳上连接细胞靶向DNA适配体，继而形成的纳米组装体可实现癌细胞靶向。Au-R2A具有高密度、分布均匀的DNA冠状结构，可以装载非常高水平的抗癌药物DOX，并高效内化到目标癌细胞，从而有效地诱导细胞死亡。这种DNA/AuNP系统可以作为一个普遍和强大的系统将药物输送到癌细胞。

撰稿人：桐豆

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