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蛋白酶体是真核生物细胞内降解蛋白质的核心部分，是一个由多个亚单位组成的桶装复合物，其包含1个20S核心颗粒、2个19S调节颗粒和许多多肽亚基，其中20S核心蛋白包括三个β亚基，β1、β2和β5。在干扰素-γ（IFN-γ）或肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等的刺激诱导下，β1、β2和β5可相应被β1i、β2i和LMP7（β5i）取代而组成新的20S免疫蛋白酶体。其中，LMP7（β5i）亚基具有糜蛋白酶样活性，参与蛋白质水解和免疫反应，是免疫蛋白酶体中最重要的活性亚基。肿瘤细胞由于存在增殖迅速及基因不稳定性的特点，使得肿瘤细胞更加依赖于蛋白酶体，以便移除错误折叠或损伤的蛋白。在增殖活跃的多发性骨髓瘤（MM）细胞中，由于高免疫球蛋白生物合成率，导致蛋白质产生错误折叠的几率更大，而因此对蛋白酶体的依赖性以及对蛋白酶体抑制剂的敏感性更高，因此，蛋白酶体被认为是治疗多发性骨髓瘤的有效靶标。至今为止，已有3款蛋白酶体抑制剂被批准用于治疗多发性骨髓瘤（图1），但却因选择性差而导致严重毒副作用和易耐药的缺点，因此，研发选择性靶向LMP7的小分子抑制剂具有重大意义，不仅能够抑制蛋白酶体，还能够解决由其他抑制剂导致的耐药问题。近日，Merck公司的Markus Klein研究员基于先前报道的蛋白酶体抑制剂4，对其进行结构修饰发现了选择性更优异的LMP7抑制剂M3258。相关成果发表在J. Med. Chem.上（DOI: 10.1021/acs.jmedchem.1c00604）。
图1 代表性蛋白酶体亚基抑制剂。图片来源：J. Med. Chem.
基于化合物4与免疫蛋白酶体的共结晶结构图和结合模式图（图2&3）。在共结晶结构图中，化合物4能够占据全部6个亚基，对β1i、β2i和LMP7表现出不同的抑制活性。根据结合模式图，作者发现化合物4的硼原子与Thr1残基的亲核氧原子的孤电子对存在共价作用并形成四面体配位的硼酸盐加成物；大体积的3-乙基苯基基团很好的占据了S1口袋。此外，靠近活性位点的酰胺与Ser21和Gly47残基形成的两个氢键对化合物的活性具有很大影响；另外一个酰胺则与Ala49和Ser21残基存在氢键相互作用，这与β1i、β2i和β5和化合物4的结合方式相似。
图2 化合物4与人iP共结晶结构。图片来源：J. Med. Chem.
图3 化合物4与β1i、β2i和LMP7的结合模式。图片来源：J. Med. Chem.
基于上述构效关系，作者提出假设：适当减少氢键相互作用和取代第二个酰胺或许能够提高化合物对LMP7的选择性（图4）。首先，作者尝试用高度取代的磺酰胺或三级胺取代R2基团，但发现无法达到选择性、代谢稳定性和渗透性的平衡。为了提高化合物的物化性质和降低tPSA，作者将优化重点置于减少R2氢键受体和供体数量去占据S2/S3口袋同时优化大体积R1基团去占据S1口袋。
图4 结构优化策略。图片来源：J. Med. Chem.
首先，作者在R2位置引入能与Cys48残基形成范德华力相互作用的苄基并将其固定，对R1取代基进行了筛选（图 5）。引入异丁基得到化合物15，其对LMP7和β5的抑制活性仅为1000 nM和15000 nM。将异丁基替换成苄基得到化合物16，其对LMP7的抑制活性提高了6倍，但对β5的抑制活性不变。基于活性更为优异的化合物16，作者在苯环上引入非极性取代基甲基、二甲基和卤素分别得到化合物17-20，其中化合物17和19-20对LMP7的抑制活性显著增加，猜测可能是与S1口袋的亲脂性相互作用增强导致的。对于选择性而言，带有双甲基的化合物18-19的选择性明显更好（>150）。作者又尝试改变取代基构象得到化合物21，但其抑制活性和选择性均显著降低（19 vs 21）。
图5 R1基团构效关系。图片来源：J. Med. Chem.
根据化合物4的分子对接研究，作者认为双环芳香取代基能够增强化合物选择性（图 6）。于是，作者引入2-苯并呋喃环得到化合物22，其对LMP7的抑制活性有所提高，但选择性没有明显变化。将2-苯并呋喃替换成区域异构体3-苯并呋喃环得到化合物23，其对LMP7的抑制活性达到了2.1 nM，并且选择性也大大提高（> 400）。基于化合物23，作者又尝试在苯环上引入甲基、甲氧基和卤素得到化合物24-29，但活性和选择性均没有显著提高。此外，作者还研究了部分饱和的氧杂双环取代基对活性的影响，相比于化合物23，化合物30表现出优异的LMP7抑制活性和选择性（1.8 nM），但其细胞活性却有所下降。其中化合物23的活性和选择性最为优异，可以作为进一步结构优化的基础。
图6 R1基团构效关系。图片来源：J. Med. Chem.
接下来，作者基于化合物23对R2进行筛选（图7）。将苯环替换成吡嗪、嘧啶、吡啶和吡唑得到化合物33-37，其活性没有明显变化，但选择性却显著降低，猜测可能是引入的氢键受体与β5和LMP7均有额外的相互作用。因此，作作者开始对苯环进行修饰，发现引入氰基得到的化合物38，其选择性略有提高。于是，作者结合氰基和上述R1取代基得到化合物39-41，发现选择性显著提高（> 700），但相比于化合物23，化合物39的口服生物利用度仅为13%。
图7 R2基团构效关系。图片来源：J. Med. Chem.
基于前期对R1和R2的筛选，作者选择3-苯并呋喃环为R1取代基，重新对R2进行筛选（图8）。引入甲基得到活性和选择性较差的化合物42，而引入α-和β-醚得到化合物43和44，其LMP7抑制活性和选择性均有所提高，这可以解释为化合物的氧原子与Ala49的NH形成了新的氢键相互作用（图9A）。用R或S构型的2-四氢呋喃或3-四氢呋喃替换醚得到一系列化合物45-48，但发现活性和选择性没有明显改善，作者认为呋喃环氧原子需要一定的转向才能与Ala49-Cys48形成的肽键形成氢键相互作用。因此，作者猜想引入双环系统将氧原子锁定在活性构象，能够达到增强抑制活性和选择性的目的，基于此，作者设计出化合物49和50及其endo异构体51和52，其中化合物50表现出极为优异的活性和选择性。接着，作者进行了化合物50与20S iP的共结晶研究（图9B、C&D），证明了化合物50的氧原子与S2口袋存在氢键相互作用，且刚性的双环结构限制了醚氧原子与其他iP和cP亚基形成氢键，保证了化合物对LMP7的选择性。
图8 R2基团构效关系。图片来源：J. Med. Chem.
图9 R2基团构效关系。图片来源：J. Med. Chem.
作者对化合物45-50进行了初步的物化性质研究（图10）。环状醚如THF被证实是易代谢位点，而双环醚基团由于空间位阻或因为刚性的金字塔状构象不利于形成易代谢的自由基中间体而具备一定的代谢稳定性，从表中能看出，化合物45-48的代谢稳定性明显差于化合物49-50，且化合物50在小鼠和人肝细胞的清除率分别为15和6.2 μL/min/106细胞。
图10 化合物45-50的物化性质。图片来源：J. Med. Chem.
基于上述实验，作者评估了化合物50对多种亚基的选择性（图11）。从表中可以看出，化合物50表现出优异的的选择性，仅对LMP7有优异的抑制活性，而对其余6种亚基没有明显的抑制作用。表明化合物50具有成为选择性LMP7抑制剂的潜力。
图11 化合物50的活性。图片来源：J. Med. Chem.
基于化合物50的抑制活性和选择性，作者对其进行了体内抗肿瘤活性研究（图12）。在MM细胞系U266B1小鼠移植肿瘤模型中，当口服剂量为0.3 mg/kg时，化合物50能够有效抑制肿瘤生长，但剂量为0.1 mg/kg时，对肿瘤生长没有表现出明显的影响，但剂量变化并未出现明显的体重下降和毒性。最后，作者进行了单次口服给药PK/PD实验（图13）。随着剂量的增加，肿瘤LMP7活性被抑制的时间也在增长，呈现出一定的剂量依赖性。
图12 化合物50的体内药效研究。图片来源：J. Med. Chem.
图12 化合物50的PK性质研究。图片来源：J. Med. Chem.
α-氨基硼酸片段的合成路线如图所示（图13）。首先，化合物5经Pd-催化的硼基化反应得到化合物6，6再经酯交换反应得到手性化合物7。接着，化合物7经BuLi和ZnCl2两步得到α-S-氯硼酸盐8。最后，经LiHMDS和HCl处理得到R-构型衍生物10，其余片段也可通过类似方法合成得到。
图13 化合物10的合成。图片来源：J. Med. Chem.
小结：Markus Klein研究员团队基于先前报道的化合物发现了高选择性、高口服生物利用度的LMP7蛋白抑制剂，展现出一定的临床潜力，未来或许有望进入市场，为治疗多发性骨髓瘤提供了新的治疗手段。参考文献：
[1]Micale, N.; Scarbaci, K.; Troiano, V.; et al. Peptide-based proteasome inhibitors in anticancer drug design. Med. Res. Rev. 2014, 34, 1001-1069.
[2]Ettari, R.; Zappala, M.; Grasso, S.; et al. Immunoproteasome-selective and non-selective inhibitors: a promising approach for the treatment of multiple myeloma. Pharmacol. Ther. 2018, 182, 176-192.
[3]Basler, M.; Groettrup, M. Recent insights how combined inhibition of immuno/proteasome subunits enables therapeutic efficacy. Genes Immun. 2020, 21, 273-287.
原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.1c00604
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