Science | 类GSDM蛋白的新型孔道形成机制

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焦亡是最初在哺乳动物中发现的一种溶解性细胞死亡形式，该过程由GSDM (gasdermin) 家族蛋白介导¹。该家族成员由N端的GSDM-N和C端的GSDM-C共同组成，GSDM-C通常起到抑制GSDM-N活性的作用。只有水解去除C端自抑制结构域并释放具有孔道形成能力的N结构域时， GSDM孔道才能形成²。

2024年5月17日，来自中国科学院生物物理研究所的丁璟珒研究员和邵峰研究员共同通讯在Science上发表了题为Cleavage-independent activation of ancient eukaryotic gasdermins and structural mechanisms的科研论文。该工作揭示了2种GSDM样的蛋白不依赖于切割活化的孔道形成机制。

图1. TrichoGSDM及RCD-1的活化机制

在搜索人源GSDM的N结构域同源的蛋白时，研究者在Trichoplax adhaerens中发现了仅由250个氨基酸残基组成的TrichoGSDM，该蛋白与人源GSDME和PJVK的N结构域之间有约24%的序列一致性，与其他人源GSDM的同源性较低。GSDME在进化上最早出现于刺胞动物门 (phylum Cnidaria)，是所有哺乳动物GSDM的祖先。然而，TrichoGSDM显然出现得更早 (图2)。

图2. TrichoGSDM在进化上早于GSMDE出现

TrichoGSDM可以单体或二聚体的形式稳定存在 (图3A)，单体TrichoGSDM可以在含心磷脂的脂质体上形成孔道结构 (图3C)，这一性质与具备孔道形成活性的GSDME十分相似 (PJVK没有孔道形成活性)，相比之下，二聚体TrichoGSDM则不具备这种特性。

图3. TrichoGSDM单体具有孔道形成活性

研究者尝试通过晶体结构的解析对TrichoGSDM形成孔道的机制进行探究，然而，在结晶的过程当中，有成孔活性的TrichoGSDM单体极容易发生沉淀，最终只有二聚体的晶体结构被成功解析，该结构与哺乳动物GSDM的N结构域在自抑制状态下的结构十分相似，因而在一定程度上解释了二聚体不具备成孔活性的机理 (图4D)。此外，两个在晶体学上对称的分子互作的界面上存在3个明确的分子间二硫键的密度 (图4E)，在此基础上利用TCEP破坏二硫键或将成键的Cys突变为Ser后都可以将二聚体成功变为单体，且Cys突变所产生的单体在脂质体上表现出明显的成孔活性。以上结果提示，在生理环境下，TrichoGSDM极有可能是通过二硫键的还原而被激活的，在后续的实验中，研究者也在功能水平对这一点进行了验证。

图4. TrichoGSDM二聚体晶体结构

在后续解析的冷冻电镜结构中，分辨率最高的类型分别达44次和41次对称，二者在整体结构上无显著差异。与哺乳动物的GSDM孔道相比，TrichoGSDM形成孔道的直径要大得多，内、外直径分别达约290 Å和390 Å (图5A)。就单体结构而言，TrichoGSDM孔道与哺乳动物GSDM孔道同样没有显著差异。与处于失活状态的TrichoGSDM，电镜结构中成孔的TrichoGSDM在球形结构域上无明显变化，但其余部分发生了剧烈的重排 (图5B)，β4-β5 linker折叠形成新的β发夹结构，与β4和β5融合，而连接β7和β8的loop则形成一个长的β折叠，β8和β9融合形成另一个长的β折叠。球形结构域中的碱性斑块 (图5C) 则可能通过识别膜中酸性磷脂的极性头部起到膜锚定作用。

图5. TrichoGSDM孔道结构

在相邻的单体之间，一共有3个互作界面存在 (图6D)，其中2个存在于球形结构域上，另外1个位于跨膜的β发夹结构上。互作界面上氨基酸残基的突变，或者球形结构域与膜接触部位氨基酸残基的突变都会减弱TrichoGSDM的成孔活性，甚至导致其活性完全消失 (图6D)。

图6.TrichoGSDM孔道相邻单体间的相互作用

有研究报道，丝状真菌N. crassa在异体识别的过程中会经历rcd1 (regulator of cell death-1) 以来的细胞死亡³。在细胞融合的过程中，由于不同株系携带编码RCD-1-1和RCD-1-2的不相容的rcd-1等位基因，细胞的溶解性死亡会被触发。RCD-1-1与RCD-1-2在结构上高度同源，与哺乳动物GSDM的N结构域远缘同源，在哺乳动物细胞中共表达二者会发生类似焦亡的细胞溶解性死亡。TrichoGSDM的发现促使研究者对此类仅有孔道形成结构域的GSDM进行了进一步的探究。RCD-1-1和RCD-1-2采取相似的折叠形式，其核心的β片层结构域GSDM的N结构域非常相似 (图7A)，RCD-1具备球星结构域，但缺少哺乳动物GSDM N结构域中的N端螺旋 (图7B)。

图7. RCD-1-1和RCD-1-2晶体结构

研究者发现，只有当RCD-1-1和RCD-1-2共同存在时，与孔道形成相关的细胞毒性才会发生。在本文解析的冷冻电镜结构中，该孔道由11个RCD-1-1和11个RCD-1-2交替排列形成，孔道内外径为130 Å和230 Å (图8)。与晶体结构相比，单体RCD-1-1/RCD-1-2球形结构域部分同样没有明显的构象变化发生，相比之下，β2到β3、β4到β5的linker则形成了大幅的构象变化。在与其他GSDM对于的磷脂结合区域，两个RCD-1亚基都缺乏有序的β2，转折区无法与膜接触。然而，α3之后的loop向外突出并指向膜，RCD-1-1上4个串联的Met和RCD-1-2上的两个Leu可能扮演着膜锚定的作用。

图8. RCD-1孔道结构

相邻的RCD-1-1和RCD-1-2之间存在2个相互作用界面，相比之下，界面II (图9, Interface II) 比界面I (Interface I) 具有更多且更强的亚基间相互作用。界面Ia上H12A/Y13A或E121A/Y125A突变并不影响孔道的形成和功能发挥，然而，界面IIa上R225A或D44A突变则会导致孔道功能消失。此外，界面IIb上D72-S74-S76或K204-K206-K208的突变也会极大的影响孔道的功能。

图9. RCD-1孔道相邻亚基间相互作用

有趣的是，在脂质体漂浮试验中，研究者发现RCD-1-1或RCD-1-2单独存在时即可与脂质体紧密结合，且在N. crassa中，RCD-1-1或RCD-1-2本身即可在膜中富集 (图10)，这种静息状态下与膜的结合在其他GSDM中并不常见。在此基础上，只有当RCD-1-1和RCD-1-2混合时，才能观察到明显的孔道形成。如果孔道中的RCD-1-2被RCD-1-1替代，界面IIb由于空间位阻将无法形成，而当RCD-1-1被RCD-1-2替代时，出于同样的原因，界面IIa的形成将受到影响。

图10. RCD-1膜结合活性

本文所探究的TrichoGSDM和RCD-1均为不具备自抑制结构域的类GSDM蛋白，可以以不依赖蛋白裂解的方式被激活。二者孔道形成的方式体现了GSDM激活机制的多样性，并提示这一新的、具有孔道形成能力的蛋白可能具有广泛的病理生理作用。

供稿 | 王彤彤

责编 | 囡囡

设计 / 排版 | 可洲 王婧曈

参考文献

参考文献

[1] Zeisel, S. H. & da Costa, K.-A. Choline: an essential nutrient for public health. Nutr. Rev. 67, 615–623 (2009).

[2] Diamond, I. Choline metabolism in brain: the role of choline transport and the effects of phenobarbital. Arch. Neurol. 24, 333–339 (1971).

[3] Meyer, E. et al. Mutations in FLVCR2 are associated with proliferative vasculopathy and hydranencephaly-hydrocephaly syndrome (Fowler syndrome). Am. J. Hum. Genet. 86, 471–478 (2010).

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