新冠论文简介6：只有 2% 的 SARS-CoV-2 阳性个体携带了社区中 90% 的病毒

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作者   杨庆，塔萨 K.萨尔迪，帕特里克 K.冈萨雷斯，埃里卡拉斯达，Carolyn J. Decker , Kimngan L. Tat ,摩根 R. 芬克、科尔 R. 哈格、.。。。。

PNAS 2021 年 5 月 25 日

由纽约州纽约市西奈山伊坎医学院的 Peter Palese 编辑，2021 年 4 月 11 日获得批准（2021 年 3 月 8 日收到审核）

意义

我们分析了科罗拉多大学博尔德分校部署的基于唾液的 COVID-19 筛查数据。我们的数据集的独特之处在于，所有 SARS-CoV-2 阳性个体在收集唾液时都没有报告任何症状，因此被感染但无症状或无症状。我们发现 1) 在我们无症状的大学人群中观察到的病毒载量分布与住院人群中报告的病毒载量分布无法区分；2) 无论症状状态如何，大约 50% 的 SARS-CoV-2 检测呈阳性的个体似乎处于感染的非传染性阶段；3) 只有 2% 的感染者携带了社区内 90% 的病毒粒子，它们既是病毒的“超级载体”，也可能是超级传播者。

摘要

我们分析了科罗拉多大学博尔德分校 2020 年秋季大流行应对工作的数据，其中使用 qRT-PCR 对 72,500 多个唾液样本进行了严重急性呼吸系统综合症冠状病毒 2 (SARS-CoV-2) 检测。所有样本均来自在采集当天未报告与 COVID-19 相关症状的个体。从这些中，确定了 1,405 例阳性病例。这些无症状个体中病毒载量的分布与先前在有症状个体中观察到的分布没有区别。无论症状状态如何，大约 50% 的 SARS-CoV-2 检测呈阳性的个体似乎处于该疾病的非传染性阶段，因为其病毒载量很低，很少能从中分离出活病毒。我们发现，在任何给定的时间，

严重急性呼吸系统综合症冠状病毒 2 (SARS-CoV-2) 是一种新型冠状病毒，于 2019 年底出现在人群中 ( 1 )，可能来自动物宿主 ( 2 , 3 )。在随后的全球大流行期间，已经有超过 300 万人因该病毒丧生。迄今为止，SARS-CoV-2 的传播极难控制。造成这种情况的一个关键原因是，无症状感染者和无症状感染者都可以将病毒传播给他人（4 ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ – 13）。此外，越来越明显的是，某些人在传播超级传播事件方面发挥着关键作用（14 ⇓ ⇓ – 17 )。在这里，我们分析了一个大型大学监控项目的数据。唾液中的病毒载量已被证明是一种可获取且可靠的生物样本，可用于识别这种呼吸道病原体的携带者，也是 SARS-CoV-2 传播最可能的媒介 ( 18 ⇓ – 20）。我们的数据集的独特之处在于，所有 SARS-CoV-2 阳性个体在收集唾液时都没有报告任何症状，因此被感染但无症状或无症状。我们发现，我们校园中 SARS-CoV-2 病毒载量的分布与之前在有症状和住院的个体中观察到的情况没有区别。引人注目的是，这些数据集证明了个体之间病毒水平的巨大差异，极少数受感染个体携带了绝大多数感染性病毒粒子。

结果

科罗拉多大学博尔德分校 SARS-CoV-2 筛查行动。

我们分析了 2020 年秋季学期（2020 年 8 月 27 日至 12 月 11 日）在科罗拉多大学博尔德校区进行的 SARS-CoV-2 测试产生的数据。宿舍的住户每周接受一次测试，几个校园测试站点在整个学期都在运行，为任何校园附属机构提供测试。在收集唾液时，要求参与者确认没有症状；因此，通过本次监测检测确定的任何感染者在收集唾液时均无症状或无症状。应该指出的是，本文分析的所有样本都是在 B.1.1.7（“英国”）SARS-CoV-2 变体以及随后的主要关注变体在最后几周首次在美国被记录之前收集的2020 年和 2021 年初（21 )。

在 2020 年秋季学期，对 72,500 多个唾液样本进行了 SARS-CoV-2 筛查。使用 qRT-PCR 检测，模板来自直接添加唾液，无需 RNA 纯化 ( 22 )。三个 TaqMan 引物/探针组用于针对 SARS-CoV-2 基因组的两个区域（CU-E 和 CU-N，其中 CU 代表科罗拉多大学）和宿主转录本 (CU-RNaseP) 的多重反应) 作为对照。多重反应用于创建标准曲线，以将每个引物组的 Ct 值（循环阈值）转换为原始唾液样本中的病毒载量（每毫升病毒数）（SI 附录，图 S1 A））。为确保 Ct 值极低（即病毒载量极高）的样本的病毒载量定量准确，我们对本学期观察到的最高病毒载量的三个唾液样本进行了连续稀释，并显示 Ct 值呈线性比例与稀释系数（SI 附录，图 S1 B）。

从筛选的 72,500 多个唾液样本中，确定了 1,405 个 SARS-CoV-2 阳性样本。这些阳性样本中的绝大多数来自独特的个体，因为检测呈阳性的个体被引导到医疗保健系统中进行进一步的检测和护理。这些1405个个体的Ct值，每个所使用的两个引物组的分布，示于图1中甲。总体而言，SARS-CoV-2 病毒载量的分布符合以 2.1 × 10 7病毒粒子/mL（中值 = 1.1 × 10 6病毒粒子/mL）为中心的对数正态分布，对于 CU-E 引物或 5.9 × 10 6 个病毒粒子/mL（中值 = 2.5 × 10 5 个病毒粒子/mL）用于 CU-N 引物（SI 附录，图 S3 )。观察到的最高病毒载量超过每毫升6 万亿 (6.1 × 10 12 ) 个病毒粒子，这仅在一个个体中观察到。值得注意的是，这个人当时在校园里，在我们的测试地点没有报告任何症状。检测到的最低病毒载量为每毫升 8 个病毒粒子。因此，监测测试表明受感染但看似健康（无症状）的个体的病毒载量差异极大。

图1  我们校园人口中的唾液病毒载量分布。( A ) 显示了 2020 年秋季学期在校园内确定的 1,405 个阳性样本中测得的病毒载量分布。每个直方图显示了使用针对 E 基因（“CU-E”）的 TaqMan 引物/探针组获得的 Ct 值或 SARS-CoV-2 的 N 基因（“CU-N”）。横轴标以Ct值和从标准曲线计算每个引物组对应的病毒载量（两个SI附录，图S1甲）。ND 表示没有数据，因为病毒载量低于 qRT-PCR 检测限。( B ) A 中两个引物组产生的 Ct 值高度相关，尤其是在病毒载量高（Ct 值低于 30）的样本中。Pearson 相关系数 (PCC) 显示在 Ct = 30 任意截止值之内和之外。（C）对于 105 个 SARS-CoV-2 阳性唾液样本，我们与 SARS-CoV-2 诊断测试中常用的八组不同引物并排运行 qRT-PCR（SI 附录，图 S2）。在这里，我们展示了与B相同的分析，除了针对 E 和 N 基因的 CDC 引物（参见方法）。

为了验证这些病毒载量分布不受所用特定 qRT-PCR 引物的影响，我们确定了 CU-N 和 CU-E 引物之间关于样品产生的 Ct 值的一致性。由于引物效率的差异和反应设置过程中的人为移液错误，不同的引物组预计会在同一样品上产生略有不同的 Ct 值。尽管如此，我们发现 Ct 值 <30（CU-N 和 CU-E Ct 值之间的 Pearson 相关系数 = 0.92）的样本中存在紧密相关性，但这种相关性在 Ct 值较高的样本中分解（CU -N 和 CU-E Ct 值 = 0.10；图 1 B）。在高 Ct 值（即低病毒载量）下，较弱的相关性可能是逆转录和/或 PCR 初始轮次随机性的结果。对 105 个 SARS-CoV-2 阳性样本进行的深入分析支持了这一点，其中每个样本都用 SARS-CoV-2 诊断测试中常用的八组不同引物进行了分析（图1C和SI）附录，图 S2 )。我们看到在相同样品上使用不同引物生成的 Ct 值之间存在紧密的一致性，尤其是在 Ct 值 <30 时。总体而言，由于 CU-E 引物组在本次深入比较中与其他引物组表现出最高的一致性（SI 附录，图 S2)，我们使用由该引物组产生的 Ct 值来计算从这一点向前的唾液病毒载量。

无论症状状态如何，人群都具有相似的病毒载量分布。

接下来，我们将校园内在样本收集时没有症状的个人的病毒载量与在有症状的个人的唾液中进行的类似病毒载量测量进行了比较。我们检查了已发表的 SARS-CoV-2 qRT-PCR 数据集，这些数据集源自对住院（因此有症状）个体的研究。我们特别寻求分析唾液和报告病毒载量的研究，因为 Ct 值是实验室和检测特定的 ( 23 )。我们确定了 404 个符合此类标准的数据点，这些数据点是我们从SI 附录表 S1 中列出的 10 项研究中整理出来的. 我们注意到，与医院样本相比，我们的校园样本可能代表了感染过程中更早的平均时间点，医院样本主要是在症状出现后收集的。尽管如此，与校园无症状人群的病毒载量分布相似（平均 = 2.1 × 10 7病毒粒子/mL，中值 = 1.1 × 10 6病毒粒子/mL），有症状患者唾液样本中的病毒载量显示为对数正态分布平均每毫升2.5 × 10 7 个病毒粒子（中值 = 9.4 × 10 5 个病毒粒子/毫升），从非常高的病毒载量（每毫升9.5 × 10 10 个病毒粒子）到接近检测极限的病毒载量（每毫升 1.3 个病毒粒子） ) (图 2 A和SI 附录，图 S3 )。我们接下来绘制了两个群体中病毒载量的累积分布（图2B）。这种比较确实代表了两个极端：一组主要是住院治疗，而另一组代表大部分是年轻和健康（但受感染）的大学人口。然而，分布非常相似（两侧双样本 Kolmogorov-Smirnov 检验，D 统计量 = 0.03， P值 = 0.97；图 2 B）。因此，无论症状如何，个体的唾液病毒载量分布相似，正如在前鼻或鼻咽拭子中病毒载量的研究中所观察到的一样 ( 24 ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ –29 )。

图 2。无症状和有症状人群的病毒载量分布相似。（A）我们无症状校园人群（n = 1,405，蓝色）中唾液病毒载量的直方图与来自有症状（n = 404，红色）个体的相同唾液病毒载量直方图相比。后者代表从SI 附录表 S1 中的 10 项研究汇编的数据。给定总体均值和标准差，对数正态概率密度函数拟合到两个分布上。（B）无症状（n = 1,405，蓝色）和有症状（n）唾液病毒载量的经验累积分布函数（ECDF）= 404，红色）人口。使用 Kolmogorov-Smirnov 检验评估两个 ECDF 的相似性，结果 D 统计量 = 0.03，P值 = 0.97。

一小部分人携带大部分循环病毒。

我们接下来分析了病毒如何在种群内的个体之间分布。通过基于代表每个群体的内插概率密度函数对个体的病毒载量求和，从具有最高病毒载量的那些人开始，我们发现只有 2% 的个体拥有 90% 的循环病毒体（图 3））。在大学（即无症状）和住院（即有症状）人群中都是如此。此外，99% 的社区循环病毒只占无症状人群的 10% 和有症状人群的 14%。在无症状和有症状的人群中，唾液病毒载量最高的一个个体携带的病毒粒子占总循环病毒的 5% 以上。另一方面，所有唾液病毒载量低于每毫升10 6病毒粒子的个体（代表约 50% 的受感染个体）在两个群体中都含有少于 0.02% 的病毒粒子。这可以理解，因为Ct是病毒载量对数增长的线性表示，所以病毒载量随着Ct值的降低呈指数增长（SI附录，图 S1 )。因此，两个人群中病毒的分布高度不对称，只有少数人携带了绝大多数病毒。尚不清楚这些是能够携带极高病毒载量的特殊个体，还是许多受感染的个体在极短的时间内经历了极高的病毒载量（见下文进一步讨论）。不管机制如何，在任何给定的时刻，一小部分人都藏有绝大多数病毒粒子，这是事实。

图 3。一小部分人是病毒超级携带者。所示的直方图（右侧y轴）与图 2中所示的相同。从每个直方图的左侧开始（即那些病毒载量最高的个体），我们根据分布的概率密度函数（蓝线和红线，以及左y轴）。在无症状（蓝线）和有症状的人群（红线）中，携带 90% 和 99% 传播病毒的人群部分以虚线突出显示。我们估计只有大约 50%（显示面板中的 51% 和 42%）的病毒检测呈阳性的个体实际上携带传染性病毒粒子，这是基于观察到很少从病毒载量 <10 的样本中分离出活病毒。每毫升6 个病毒粒子 ( 28 , 30 ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ – 35）。在上下文中，显示了常见 SARS-CoV-2 诊断测试范式（qRT-PCR、抗原测试和逆转录环介导的等温扩增）的检测限范围。所有测试范式都将捕获几乎所有感染性个体和病毒体，无论是在症状前还是有症状的人群中。检测限取自参考文献。50到52。

很少从病毒载量低于每毫升10 6病毒体的个体的临床样本中分离出感染性病毒体 ( 28 , 30 ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ – 35 )。一种假设是，处于这种低病毒载量范围内的人可能只是从正在修复的受损组织中脱落病毒基因组，因此，他们可能不会构成感染他人的重大风险。根据这一推理，我们的分布表明，大约一半的检测呈阳性的人可能不会传染给他人（图 3）。

讨论

这里的一个重要发现是，社区中绝大多数的循环病毒粒子都存在于少数个体的体内。这些发现证实了在其他地方观察到的类似趋势 ( 14 ⇓ ⇓ – 17 , 25 )。尽管传播概率与病毒载量的确切关系还有待观察，但一个强烈的暗示是，这些病毒超级携带者也可能是超级传播者。在中国 ( 36 )、西班牙 ( 37 ) 以及我们大学校园的室友之间 ( 38 )，较高的病毒载量已被证明会增加传播给其他人的可能性。）。病毒超级携带者的更高传播率与最近的接触者追踪分析一致，表明 80% 到 90% 的感染是由 10% 到 20% 的感染者引起的 ( 14 ⇓ ⇓ – 17 )。病毒超级携带者的较高传播率也与室友（38）、同学（39 , 40）和家庭成员（41）之间报告的令人惊讶的低传播率相一致，这可以解释为只有一小部分受感染的个体具有足够高的病毒载量以促进主动传播。

个体之间病毒载量差异的一种可能解释是，个体只是在其他相似病毒感染的不同阶段进行了测试。然而，对个体感染的纵向分析表明，个体之间的峰值病毒载量差异很大 ( 42 ⇓ – 44 )。因此，简洁的解释是个体产生不同水平的病毒。这是否是由于免疫反应的变化、支持病毒复制的宿主因素（如 ACE2）的变化、特定的病毒变体感染或初始感染部位或剂量仍有待确定（45 ⇓ ⇓ – 48）。为了进一步研究这一点，我们使用分位数-分位数图（SI 附录，图 S3）将此处分析的病毒载量分布与理论正态分布进行了比较。数据在极端情况下偏离正态分布，包括病毒载量最高的部分人群。这与以下假设一致，即一小部分个体代表一个独特的群体，其感染能力与其他群体不同。

在给定时间，大多数病毒在一小部分人群中的浓度是具有可操作性结论的重要观察结果。社区筛查以在疾病的症状前和无症状阶段识别病毒超级携带者将很重要，因为这些人如果没有找到，将继续维持和推动流行。寻找病毒超级携带者将对遏制新的 COVID-19 感染产生不成比例的巨大影响，但没有症状的个人并不倾向于寻求检测，因此筛查需要针对健康人群。建模方法表明，筛查 SARS-CoV-2 的最重要因素之一是感染者收到检测结果的速度（也称为周转时间）（49）。人们收到结果所需的时间越长，他们可能在不知不觉中感染他人的时间就越长。因此，我们必须找到病毒超级携带者，并以一种快速、简单和可访问的方式告知它们的感染状态。尽管当前监测和诊断范式之间的检测限有所不同，但它们都能够找到大多数感染者和绝大多数正在传播的病毒体（图 3）（50 ⇓ – 52）

方法

大学样本的收集。

对于在我们大学进行的样本收集，个人被要求填写一份问卷 ( https://www.colorado.edu/daily-health-form ) 以确认他们没有出现任何与 COVID-19 一致的症状，并将不少于 0.5 mL 的唾液收集到 5 mL 螺旋盖收集管中。唾液样品在现场在 95°C 下加热 30 分钟以灭活病毒颗粒以进行更安全的处理，然后将其置于冰上或 4°C 下，然后在同一天运往检测实验室进行 qRT-PCR 分析。

唾液 qRT-PCR 用于在科罗拉多大学博尔德校区筛选唾液样本。

对于 qRT-PCR 分析，大学检测团队将 75 μL 唾液转移到 96 孔板的一个孔中，每个孔中预装了 75 μL 2× Tris/硼酸盐/乙二胺四乙酸 (TBE) 缓冲液，并添加了 1%吐温 20。然后将 5 μL 稀释样品加入单独的 96 孔板的一个孔中，其中每个孔都预装了 15 μL 由 TaqPath 1-Step Multiplex Master Mix (Thermo Fisher A28523) 组成的反应混合物，不含核酸酶水和由 CU-E、CU-N 和 CU-RNaseP 引物和探针组组成的三重引物混合物（表 1; 学期期间情况略有变化）。将试剂混合、离心并加载到 Bio-Rad CFX96 或 CFX384 qPCR 机器上。qRT-PCR 使用标准模式运行，包括一个保持阶段（25°C 2 分钟，50°C 15 分钟和 95°C 2 分钟），然后是 44 个循环的 PCR 阶段（95°C C 3 秒，55 °C 30 秒，上升和下降速率为 1.6 °C/s）。来自所有校园测试工作的 Ct 值作为去识别化数据传达给我们。

表格1。用于大学镜头和重点分析的 qRT-PCR TaqMan 引物/重点组  （略）

105 个 SARS-CoV-2-阳性样本的重点分析。

对于本文所述的 105 个样本的较小子集，我们对 SARS-CoV-2 诊断中常用的三种不同的 qRT-PCR 多重检测进行了并排比较。我们解冻了之前在校园筛查操作中检测出 SARS-CoV-2 呈阳性的 105 份冷冻、去识别化的唾液样本，并在样本解冻当天并排进行了以下所有 qRT-PCR 分析。

首先，将 25 μL 解冻、预先热处理的唾液转移到 96 孔板的一个孔中，其中每个孔都预装了 25 μL 2× TBE 缓冲液，并补充了 1% Tween-20。接下来，将 5 μL 稀释样品添加到单独的 96 孔板中，其中每个孔都预装了 15 μL 由 TaqPath 1-Step Multiplex Master Mix (Thermo Fisher A28523)、无核酸酶水和 US 组成的反应混合物疾病控制中心 (CDC) 三重引物混合物或 CU 三重引物混合物（表 1））。将试剂混合、离心并加载到 Bio-Rad CFX96 qPCR 机器上。qRT-PCR 使用标准模式运行，包括一个保持阶段（25°C 2 分钟，50°C 15 分钟和 95°C 2 分钟），然后是 44 个循环的 PCR 阶段（95°C C 3 秒，55 °C 30 秒，上升和下降速率为 1.6 °C/s）。每个板还包含两孔阴性对照模板（5 μL 无核酸酶水，用 2× TBE 以 1:1 稀释，辅以 1% Tween-20）和两孔阳性对照模板（5 μL 合成 SARS-CoV- 2 RNA [Twist Biosciences 102024] 稀释至每微升 1,000 个基因组拷贝，5 µL 总人类参考 RNA [安捷伦 750500] 在无核酸酶水中稀释至 10 ng/微升）。

我们还对每个样本进行了 SalivaDirect TaqMan qRT-PCR 分析 ( 20 )；每个唾液样本的 75 μL 与 9.4 μL 蛋白酶 K（20 mg/mL，New England Biolabs，P8107S）混合。将样品在环境温度下孵育 15 分钟，然后加热至 95 °C 5 分钟以灭活蛋白酶 K。接下来，将 5 μL 唾液用作 20 μL 反应的模板，该反应还包含 1× TaqPath 1-Step多重预混液、无核酸酶水以及浓度如下所述的引物和探针组。qRT-PCR 在 BioRad CFX96 qPCR 机器上运行，使用与 CU 检测相同的程序 ( 20 )。

道德声明。

从科罗拉多大学博尔德分校对 SARS-CoV-2 的操作筛选中对大学参与者的病毒载量数据进行了去识别化和汇总。此活动不符合美国卫生与公共服务部 45 联邦法规第 46 部分中描述的人类受试者研究的定义。用于引物交叉比较的去识别唾液样本 ( n = 105) 是根据协议 20 收集的 - 0662，经科罗拉多大学博尔德机构审查委员会批准。

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原文地址https://www.pnas.org/content/118/21/e2104547118

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