猝不及防，导师得了诺贝尔化学奖 | Nature and You
科考夫第二季重新启航，我们又回来啦！
撰文 | 陈凯
访谈 | 丁霄哲
编辑 | 石悦琳 陈欣泓
在获悉得奖当天的庆祝晚宴上，2018年诺贝尔化学奖得主Frances Arnold（中）与同事Kip Throne（左，2017年物理奖得主）、David Baltimore（右，1975年生理学及医学奖得主）上合影。（图片来源：Twitter @NobelPrize）
2018年， Frances H. Arnold教授因其在“酶的定向进化”领域的贡献获得诺贝尔化学奖，她是诺贝尔化学奖历史上第五位女性得主。George P. Smith教授和Gregory P. Winter爵士因“多肽和抗体的噬菌体展示技术”领域的贡献， 共享此次诺贝尔化学奖。
加州理工学院（California Institute of Technology）的同学、Arnold实验室的博士生陈凯是诺奖委员会为今年化学奖撰写的科学背景（Scientific Background）所引用的一系列论文中的三篇的主要贡献者之一[1‒3]。本期科考夫采访了陈凯同学，请他为我们介绍了这次获得诺奖的工作、它的历史和应用，以及Arnold实验室中在这次得奖后的趣事。
问：在正式开始采访之前，我们想先八卦一些轻松的话题。你当时听到导师拿奖是在什么场景下，听到后又是什么心情？
陈凯：像很多化学系的博士生一样，每年诺奖季，我都会很关心诺贝尔化学奖这个“理综奖”究竟会颁给哪个领域。今年诺奖公布前几个小时， 我还出于好奇心对可能获诺奖的化学各个方向的前辈科学家做了一个简单的预测，在朋友圈里列了11位我自己看好的科学家。当时我也把Frances列入其中了，但其实心里觉得她离拿奖或许还需要等上几年。所以，自然也等着凌晨两点四十五分（美国加州时间）的直播，可正当公布之前，突然断网了。等我一分钟后重新连上网时，只听到了“Arnold”这一姓氏，当时不敢相信自己的耳朵、心跳开始加速，在接下去几秒钟时间内，我又听到了“directed evolution of enzyme”这个关键词，终于确信无疑就是自己导师！那之后的三四个小时之内，过于激动的心情迟迟不得平复——兴奋到凌晨四点半出门跑步——乃至之后十几个小时，完全忘了已经一天多没睡觉了！
问：所以你觉得Arnold教授这次获奖还是很意外的。那获奖前后你们实验室中还有什么有趣的事情发生吗？
陈凯：虽然一直以来Frances经常被人们猜测有获得诺贝尔奖的可能性，但Frances并未想象到“诺奖”来得如此突然。甚至，在之前聊起诺贝尔化学奖时，Frances仍感叹，不同方向下，有不少先驱前辈值得“诺奖”殊荣却还未得，比如作为加州理工学院生物无机领域的先驱Harry B. Gray，金属有机以及碳氢键活化领域的前辈John E. Bercaw。
整个Arnold实验室的成员，包括Frances，都没有预料到这个“诺奖”的来临，我作为组内唯一一个熬夜观看了诺奖公布直播的成员，也是震惊又欢喜。Frances说她自己接到电话时，也震惊得思绪全无；之后她想与她的两个儿子分享消息，却迟迟打不通电话，直到早晨才接到儿子的电话回复，但电话那头她儿子仍一无所知地问道：“Mom， what’s up?” （“老妈，出啥事了？”）
一件有意思的事情是，在诺贝尔化学奖公布的十天前， Nobel Prize的官方twitter曾点评了两次诺奖得主鲍林（Linus Pauling，1954年的化学奖和1962年的和平奖）的生平。Frances作为加州理工学院以鲍林冠名的讲席教授转发了这则twitter并评价，自己的教授头衔虽包含“Linus Pauling”，但与鲍林相比——“I have a rather small foot for these shoes. Sigh.” （“我的脚太小，还没法穿这样的鞋，唉。”意为自己还不够诺贝尔奖这样的级别）。谁知，几天后“诺奖”真的来了，实验室成员便调侃Frances——“@francesarnold it looks like your feet grew this week!” （“Frances， 看来这一个星期你的脚就长够大了”） —— “Evolution made it possible!” （“进化让它成为可能！”）。
问：哈哈哈，你提到了这次诺奖的关键词“进化”。Arnold教授获得诺奖的工作叫“酶的定向进化”，听上去似乎与达尔文的进化论有关。但是普通人理解的进化都是发生在生物个体层面的。能不能解释一下，“酶”是什么？为什么“酶”也可以进化？
陈凯：首先回答第一个问题，酶是生物体中负责催化功能的大分子，细胞内几乎所有生存、复制所需的代谢过程都需要各种不同的酶催化进行以持续生命。
数十亿年以来，生命从最初的单细胞生命到如今纷繁复杂的生物种群，无时不刻没有发生着演变过程。达尔文的进化论阐释了这个现象，环境的改变淘汰了不适者——还有一些个体通过自身的改变适应了环境，甚至能得益于新的环境，而存活下来。比如，在高温温泉中存活着的耐高温的嗜热菌，可以在一百摄氏度以上的环境中生存，是因为在漫长的环境变化与物种繁衍的过程中，部分细菌发生了变异，制造出的维持自身生理机能的生物大分子拥有了抗高温的性能，使得这部分的细菌得以存活。
不过，造成许多我们看到的惊人的生物个体功能的本源在于，它们的基因和基因所编码的生物大分子——特别是酶——在千百万年进化史中经历的突变和选择。在高中的生物课本中，我们就学过了绝大部分酶都属于蛋白，而蛋白在“生物中心法则”之下，由生物体的基因表达所得。所以，基因的突变导致了酶的变异，从而在自然选择的结果下，有了“进化”。所以，可以说，自然界中的生物进化很大一部分就是酶的进化。
问：那什么叫“定向进化”？
陈凯：进化拥有两个基本要素——突变与选择——突变是随机的，选择则是可以有方向性的。自然的进化需要千百万年的时间，而选择的结果也依赖于不断变化的环境因素。而人类在应用自然选择来实现自己的目的时，则会施加一个恒定的方向，所以是“定向”的。其实人类很早就开始使用“定向进化”来改造物种，比如今天的各种牲畜、农作物、或者大大小小的猫猫狗狗，可以说都是“定向进化”的产物。
（图片来源：cesarsway.com）
问：用定向进化对猫猫狗狗进行改造的动机很好理解，可是酶有什么用？为什么要对酶进行定向进化？
陈凯：酶在许多行业都有很广泛的应用，可以说是无处不在，只是普通人不太了解。
（图片来源：pharmanewsonline）
日常用的洗涤剂用酶作为促进剂；食品工业上的发酵、降解等过程酶更是必不可少；药物以及精细化工中，传统化学的一些生产过程需要重金属参与且耗能高，酶作为绿色高效催化剂已经替代了它们。此外，酶更是生物能源发展中最为重要的角色。
（图片来源：作者根据网络素材整理）
那这些用来当催化剂的酶为什么需要进化？如前所说，不同的酶都有所属的生物体，它们是为了执行生物体内的相应过程而生的。一旦脱离了原始的生物体环境，在体外甚至对酶本身具有伤害的环境中，酶在绝大多数情况下无法发挥其原本的功能。不同的温度、酸碱度（pH）、盐浓度、有机溶剂等等外在条件会极大程度影响酶的稳定性、催化活性以及选择性；而且单一的酶往往局限在单一的底物，难以普适使用。为攻克这些弊端，酶的定向进化成了必要的手段——通过引入随机突变，以提高酶某一或某几方面的性能。
问：所以是Arnold教授最早提出和进行了酶定向进化吗？
陈凯：其实并不是。在早期可能有人有过类似的想法，但都没能通过实验证明它的可行性。这一定程度上是因为早年分子生物学的技术手段有限。有据可考的一个例子是，早在1984年，1967年的诺贝尔化学奖得主Manfred Eigen便在一份专利中提出过“蛋白优化”的理论雏形——以目标蛋白为母体克隆出一系列突变体，并测试各个突变体相应的功能以选出最优者，往复 “突变-筛选”这一循环直至最优。但是他也没有进行真正的验证和应用。
直到1991年，这一方法才由Frances正式确立，这得益于当时日渐成熟的基因技术。Frances和学生们通过实验证明这种方法确实能够用于优化蛋白的性能[4‒6]，并将其应用在各个领域。
问：听说这种方法一开始受到不少主流化学家和生物学家们的抵触？
陈凯：是的。1986年，Frances在加州理工学院开始自己独立的研究工作。从一开始，Frances就着眼于通过改造蛋白结构以优化甚至创造（新的）蛋白功能。当时的主流科学家普遍认为，应该对蛋白的结构与功能之间的联系有清晰的认识，从而基于这些认识去设计更优的蛋白结构。然而，Frances却反其道，认为蛋白作为一个大分子过于复杂，并且由于缺乏研究手段，人们不可能在短时间内从原子层面上对蛋白内部的精细结构以及蛋白在执行功能时的变化有深入的认知，而在此基础上做完整的设计几乎是不可能的。果不其然，即便在今天，人们虽然已经能够利用发达的计算机技术设计全新的蛋白，但是仍需要依赖“定向进化”的手段重新优化设计出来的蛋白使其性能能够匹敌自然界已存在的蛋白。
当时，Frances这一反潮流的论断被绝大多数从事生物/化学研究工作的科学家所不理解。科学界的舆论并没有让Frances停住脚步，她告诉当时的人们：“我是个生物工程学家，我只关心我能不能把蛋白改造得更好，我并不在意我对蛋白理解得是否足够透彻。”
问：能概括地说一下，Arnold实验室验证的“酶的定向进化”的方法是怎样的流程吗？
陈凯：“定向进化”的整个工作流程分4步：
1） 针对目标功能确立初始蛋白以及对应的基因，通过不同的手段在蛋白对应的基因上引入突变以实现序列全局的一小部分覆盖；
2） 将突变基因转送至细菌，使得每个不同的突变体基因得到一一分离，相应的突变体蛋白在细菌中也得以表达；
3） 使用不同的测试方法筛选出具有更好目标性能的蛋白突变体，并通过测序手段确定其基因与蛋白序列；
4） 以获得的最优突变体为母本，进入下一个“突变-筛选”的循环，直至达到预期的蛋白性能。
蛋白“定向进化”的基本流程 （图片来源：Scientific Background on the Nobel Prize in Chemistry 2018）
与自然进化类似，“定向进化”这一项技术中，最关键的步骤还是“变异”和“筛选”（或“选择”）。有控制有效率的突变和快速简洁的筛选是定向进化的核心。
问：用“定向进化”能改造酶哪些方面的性能？
陈凯：酶的几乎所有的性能都能通过定向进化被改造。比如，在Frances实验室早期的工作中，通过“定向进化”的策略优化了一系列不同的酶在体外环境，尤其是破坏性环境中的稳定性、热稳定性和催化活性等等。
其中，催化活性往往是人们最为关注的点。酶在生物体内，往往只对个别底物催化特定的反应，也就是所谓的酶的特异性 （specificity）。然而，很多时候，酶也具有混乱性 （promiscuity），也就是说，如果给酶提供一个在结构上与天然底物具有相似性的非天然底物，有时候酶也会体现出催化活性。但是这样的催化活性，往往是非常低的。而“定向进化”则可以利用酶的混乱性这一性质，使酶的适用范围得到数量级的提升。如下图所示，当酶对非天然底物表现出非常低的活性之后，“定向进化”可以得到突变体，对该非天然的底物表现出相当高的活性。虽然这样的进化往往需要非天然底物与天然底物在结构上具有相似性，但是基于新的突变体，又可以对新的底物进行“定向进化”，周而复始，使得酶的底物范围得到大规模的扩展——这一过程称之为“底物攀行” （substrate walking）。
酶的催化混乱性与定向进化 （图片来源：参考文献[7]）
问：前面说到酶在各行各业都有广泛应用，能给一个“定向进化”在工业应用中的例子吗？
陈凯：酶的“定向进化”最为突出的一次胜利当在工业制药领域，转氨酶 （transaminase） 的进化与使用。2010年，默克公司在Science发表了“转氨酶的‘定向进化’在绿色合成2型抗糖尿病药物‘西他列汀’ （Sitagliptin， 2016年销量：2.3亿美元） 中的使用”[8]。与化学催化方法相比，进化后的转氨酶用于“西他列汀”的合成在产率上提升了10–13%，目标产物西他列汀的对映体选择性几近完美，日产量增长了53%，工业废料减少了19%，避免了重金属的使用，缩短了反应步骤，无需高压条件以及高压设备，大幅降低了工业生产成本。
西他列汀的化学合成与生物合成 （图片来源：参考文献[8]）
问：听说最近几年你们使用酶实现了许多合成化学家都无法实现的化学反应，你自己也参与了其中几项工作。可以具体介绍一下吗？
陈凯：可以啊。我们实验室在近几年试图进一步打破对酶促化学的传统认识，并展现了酶更具潜力的应用前景。传统上，人们对酶的混乱性的认识总是局限在不同的底物，但它们都属于同一类反应。基于对细胞色素P450氧化酶的深刻认识，他们从反应机理着手做相似性类比，引入了不同的反应类型——本质上，氧化反应是氧转移的过程，类比之下，P450氧化酶是不是也能实现氮转移甚至碳转移的过程呢？近五年来，我们实验室大量的工作已经证明了这一点。虽然原始的P450氧化酶抑或其他的血红素蛋白往往体现极低的催化活性，甚至很多时候难以完成一次催化过程，但“定向进化”往往是解决酶的催化活性问题的最佳策略。往往只需要几轮的进化，这些酶的催化活性就能得到指数型的增长。今年，我们利用“定向进化”策略以及这一套酶促体系又达到了新的高度，实现了在传统化学上都难以合成的高能高张力小分子碳环的生物合成[1]。这其中一部分化学也已经被应用到了制药工业中，用于高选择性高效率的制备药物中间体中。
问：自从Arnold教授成为第五位获得诺贝尔化学奖的女性后，已经有许多媒体报道过她不寻常的人生经历。作为这几年直接与她共同工作的学生， 在你看来她有哪些不同于常人的特质？
陈凯：在课题组待了三年多，Frances给我留下最深的印象是她对科学全局的审视。或许是因为她经历的多，也看得比一般人远，她总是说：科学的目的是要为人类社会的进步提供支持。也许正是这样，她希望把她提出并发展起来的技术用到科学的各个领域。Frances本科专业是机械工程，博士则是生物工程，Frances自然并不专长于 “定向进化”所遍及的所有领域。但正是因为Frances对科学全局的审视，她乐于学习一切她不专长的方向，不排斥任意一个科学方向。化学并不是她的专业，但她在持续不断地用“定向进化”的策略做化学——也许这在常人眼里难以想象，但对Frances而言，她从没停下学习。正如她自己所说，她或许不是最出色的化学家，她教酶如何进化，自己也在学习中不断进步。
Frances对科研有着常人所不能比的执念。Frances的人生路颇为坎坷，经历了不少亲人的离世，受过癌症的折磨，但从未让她在科研上有所中断甚至犹疑。她曾经说过，她的科学之路深受她父亲的影响，她和她父亲曾是美国科学界唯一一对父女档院士 （工程院，National Academy of Engineering），然而她父亲却未有机会见证她如今的成就就过世了，这不禁也让她伤感。
Frances的婚姻不算幸福，然而对她打击最大的是她第二个儿子的突然离世，我至今尚且印象深刻。2016年秋，Frances突然告诉大家她尚在念本科的儿子不幸离世的消息，所有人为她悲痛不已——如此大的不幸或许发生在其他人身上，早就被击垮了。然而，Frances花了一个星期处理了儿子的后事，便回到实验室继续工作。所有人都看在眼里，Frances整日红着眼睛，有时甚至情绪不稳，但她没有间断科研工作。我还记得她忍痛含泪在办公室与我们讨论实验进展的情形。
Frances对待科学更有自己的责任感和信念感。她希望她发展的科学与技术能为人所用，希望她的研究能为人类进步有所贡献。她从来不希望在领域之中她的科研是一枝独秀的；看到越来越多的人加入到这个领域之中并为推动这个领域发展而不断做出努力，她是非常欣慰的。当她看到好的科学，尤其是能为人类带来益处的科研，即使不在她所处的领域，她也不遗余力地推崇。她对科学的传承，有着自己的信念；她的学生，不管去了工业界还是学术界，她都毫无保留的支持——她希望看到科学界百花齐放的盛世。或许也如她所说，她在年轻的学生身上看到了与她去世的孩子一样的天真烂漫和拼搏奋斗的精神，所以她把希望寄托在了年轻的学生身上，鼓励着学生们去为这个世界做一点有意义的事，哪怕很渺小。
感谢《知识分子》的程莉老师对本文修改提供的宝贵建议！
参考文献：
[1]Chen K，Huang X，Kan SBJ，Zhang RK，Arnold FH. Enzymatic construction of highly strained carbocycles. Science，2018，360，71‒75.
[2] Kan SBJ，Lewis RD，Chen K，Arnold FH. Directed evolution of cytochrome c for carbon-silicon bond formation: Bringing silicon to life. Science，2016，354，1048‒1051.
[3] Kan SBJ，Huang X，Gumulya Y，Chen K，Arnold FH. Genetically programmed chiral organoborane synthesis. Nature，2017，552，132‒136.
[4] Chen KQ，Arnold FH. Enzyme engineering for nonaqueous solvents: random mutagenesis to enhance activity of subtilisin E in polar organic media. Biotechnology，1991，9，1073‒1077.
[5] Chen K，Arnold FH. Tuning the activity of an enzyme for unusual environments: sequential random mutagenesis of subtilisin E for catalysis in dimethylformamide. PNAS，1993，90，5618‒5622.
[6] Arnold FH. Engineering proteins for nonnatural environments. The FASEB journal，1993，7，744‒749.
[7] Renata H，Wang JZ，Arnold FH. Expanding the enzyme universe: Accessing non-natural reactions by mechanism-guided directed evolution. ACIE，2015，54，3351–3367.
[8] Savile CK，Janey JM，Mundorff EC，Moore JC，Tam S，Jarvis WR，Colbeck JC，Krebber A，Fleitz FJ，Brands J，Devine PN，Huisman GW，Hughes GJ. Biocatalytic asymmetric synthesis of chiral amines from ketones applied to sitagliptin manufacture. Science，2010，329，305–309.
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