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重点推介丨Brooks的乳酸简史——从研究者视角探讨运动“代谢物”的认识过程和方法
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漆正堂，朱钰鹏，刘微娜.Brooks的乳酸简史——从研究者视角探讨运动“代谢物”的认识过程和方法[J].武汉体育学院学报，2023,57（6）:68-76.
Brooks的乳酸简史——从研究者视角探讨运动“代谢物”的认识过程和方法
（漆正堂）
作者
漆正堂1,2，朱钰鹏1,2，刘微娜1,2
华东师范大学 青少年健康评价与运动干预教育部重点实验室，上海 200241
华东师范大学 体育与健康学院，上海 200241
从分子水平认识“运动”进而理解运动人体、把握运动与健康的规律，已成为运动生理学家的共识之一。运动产生的代谢物非常之多，为什么乳酸备受关注？乳酸在运动生理学中最初的印象是代谢废物，运动时骨骼肌积累大量乳酸。不久之后，因为乳酸产生并进入循环，导致内环境酸化，大量的酶不能工作，所以乳酸成了运动性疲劳的重要原因。乳酸导致运动性疲劳的观点已有百年之久。此外，早在1930年代就发现癌细胞在有氧条件下通过有氧糖酵解生成乳酸，后又发现乳酸诱导微环境酸化，刺激肿瘤血管生成，帮助肿瘤细胞逃脱免疫监视等［1-3］。因此，很多抗癌治疗和药物都是针对乳酸及其副作用的［4］，然而收效并不理想。运动与乳酸研究已逾百年，是乳酸变了，还是我们的认识变了？这关系到运动训练科学监控、癌症治疗、运动健康促进等诸多转化应用问题。
100年来，George A, Brooks对乳酸的研究作出了突出贡献。Brooks生于1944年，他在颇具争议的博士论文中挑战乳酸的传统观点和希尔的氧债假说。1971年Brooks加入美国加州大学伯克利分校，坚持乳酸研究50余年，最早的一篇论文探讨体温、骨骼肌线粒体功能与氧债之间的关系［5］。最近一篇文章发表于2022年，表达了他对乳酸最新的认识［6］。Brooks在不同时期对“乳酸”的认识和观点代表一部分科学家从分子水平理解运动生理学的思路和方法，这对我们认识其他分子也具有借鉴意义。本文梳理Brooks的乳酸简史，旨在从研究者视角探讨运动生理学家对于“分子”的认知过程和方法，并非综述乳酸的研究进展。
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Brooks之前：乳酸的来龙去脉
化学键理论极大地推进了有机结构研究的进展。1874年荷兰化学家范特霍夫提出了碳的四面体结构，将从牛乳中提取的发酵乳酸定义为右旋乳酸，从肌肉中提取的乳酸定义为左旋乳酸。PubMed给出的最早一篇关于乳酸的文献出现在1855年，报道了注射碘和乳酸铁到组织中作为蛇毒的解毒剂［7］，作者无从查考。1907年，研究报道离体的蛙肌在电刺激下产生了乳酸，这是运动与乳酸的第一次相遇［8］，从此掀开了“运动与乳酸”研究的百年大幕。1913年，研究阐述了两栖动物肌肉疲劳产热及其与乳酸产生的关系［9］，这是首次将运动性疲劳与乳酸联系起来。同年还有研究报道哺乳动物肌肉中乳酸的形成与呼吸之间的关系［10］。1921年，研究发现肌肉中碳水化合物与乳酸的相互转化，证明乳酸来源于糖的分解代谢［11］。英国生理学家希尔与德国生理学家迈尔霍夫共同获得了1922年诺贝尔生理学或医学奖，希尔的贡献是“在肌肉产生热量上的发现”，迈尔霍夫的贡献是发现“肌肉的氧耗和乳酸之间的固定关系”。从此，运动、氧耗、乳酸之间的关系成为运动生理学研究的热点。
1927年，首次在体内实验肌肉活动中观察到乳酸产生［12］，并报道心肌乳酸的最大值［13］，暗示心肌具有较大的乳酸代谢能力。1930年，针对乳酸在癌症和运动中的“副作用”，首次提出“抑制乳酸形成”的观点［14］，这是乳酸研究“成果”首次转化为应用策略。此后，相当一部分抗疲劳、抗癌的药物和治疗方法都是围绕“抑制乳酸形成”而开发的。1934年，在心肌组织代谢研究中确认了乳酸脱氢酶（1928年首次从细菌中分离获得），发现乳酸和丙酮酸在LDH的作用下相互转化［15-16］。1950年，发现肌肉提取物和结晶的LDH催化α、γ-二酮酸向α-酮酸的还原反应［17］，表明LDH的催化活性并不局限于乳酸与丙酮酸之间的转化。1954年、1956年，先后用蛙肌和哺乳动物进一步明确了肌肉乳酸和丙酮酸代谢之间的关系［18-19］。至此，经典生物化学的乳酸代谢通路基本明晰，乳酸通过LDH与丙酮酸的相互转化，接入四通八达的代谢网络，丙酮酸是最可能出现的代谢“堵点”，因此运动中乳酸容易形成。
1960-1970年间，运动与乳酸的研究进入“乳酸脱氢酶时代”。1961年，骨骼肌中LDH的晶体结构被解析［20］，并报道运动大鼠心脏和骨骼肌LDH活性增加［21］。1962年，Nature杂志报道骨骼肌LDH的分布［22］，并确认骨骼肌LDH的同工酶类型［23］。1964年，通过染色分布确认LDH定位于肌浆网［24］，这是首次对LDH进行细胞化学定位研究。1967年，进一步明确运动训练后大鼠心脏和骨骼肌LDH的活性变化［25］，发现血清LDH同工酶升高与骨骼肌缺血性损伤有关［26］。1968年，《新英格兰医学杂志》全面回顾了血乳酸对运动的反应［27］。1970年，用狗的腓肠肌进一步探究了乳酸形成与氧债之间的关系［28］。此外，还有大量实验采用不同的研究对象、运动方式、组织材料和检测方法，系统研究了人体腿部肌肉在休息和运动时的氧利用以及乳酸-丙酮酸代谢［29-31］。到1970年，基本达成以下共识：乳酸是细胞在缺氧条件下产生的，并导致运动性疲劳。这与希尔在1925年提出的氧债假说还是吻合的［32］，大部分研究结果只是在这一理论上添砖加瓦。
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Brooks的第一印象：希尔可能是弄错了
希尔被誉为“运动生理学之父”。他在1909-1969年间发表了大量研究论文和著作，阐述骨骼肌产热、肌张力、能量交换与耗氧之间的关系，并于1970年发表了自传［33］。1925年，希尔在一部专著中指出：“最大摄氧量受心血管和呼吸系统的限制，超过此限度后，机体对氧的需求不能得到满足，氧债持续增加，乳酸堆积，疲劳和力竭开始出现……”希尔提出的“氧债”假说，将乳酸与运动后的氧耗联系起来。他认为，运动中形成的乳酸只有1/5被氧化（因为氧不足），在恢复过程中氧耗增加，再将剩余的4/5转化为糖原［32］。这是1970年以前运动生理学的经典理论，因为他解释了乳酸产生的原因以及疲劳的机制。
Brooks于1971年连发三篇论文，对希尔的氧债学说提出了质疑。Brooks用线粒体呼吸的数据、ADP:耗氧比值与运动后氧耗的不相关性，指出“经典的氧债概念需要修正”［5, 34］。1973年，Brooks用14C标记研究大鼠力竭运动后血液、肌肉和肝脏乳酸以及肌肉、肝糖原和血糖浓度与时间的关系，发现乳酸和血糖浓度在运动后15~30分钟内恢复到非运动水平，并没有糖原合成的迹象。这与乳酸-氧债假说所预期的结果相反。运动后乳酸的主要代谢方式似乎是氧化［35］，而不是合成糖原。运动后摄氧量曲线初始部分的斜率不受工作负荷或乳酸的影响，这与“乳酸-氧债”的假设不一致［36］。1980年，Brooks通过大鼠力竭运动发现，运动后14C在蛋白质和糖原中的含量显著增加，但14C乳酸合成的糖原只占很小的部分。Brooks认为，运动后过量耗氧的经典解释(“氧债”)过于简单［37］。运动后乳酸清除对肌糖原的贡献很小［38］。经过训练的动物在低强度和高强度运动期间乳酸的代谢清除率分别比对照组高37%和107%。耐力训练的影响不在于乳酸产生，而在于乳酸清除［39］。随后，Brooks测定了不同跑速下大鼠的耗氧量(VO2)、乳酸周转和氧化，认为：尽管在运动稳态中有活跃的乳酸周转，但无氧能量产生对总能量转换的贡献不大，因为超过70%的乳酸通过氧化被去除［40］。
1985年，Brooks总结了前人与自己的研究，认为：血乳酸只能提供肌肉乳酸生成速率的最少信息，乳酸积累超过乳酸阈值只能表明乳酸去除机制未能跟上乳酸生成的速率。乳酸是骨骼肌代谢率和糖酵解碳流（carbon flow）增加的直接结果。LDH对丙酮酸的米氏常数（Km）很低，确保丙酮酸很容易转化为乳酸，而乳酸转化为丙酮酸的Km超过1mM。也就是说，丙酮酸生成乳酸的门槛很低，并非因为氧气不足。因此，无氧阈的假设是错误的，个体在次最大强度运动期间肌肉中氧的可用性并不存在限制。此外，肺的通气阈并不总是跟踪血乳酸浓度的变化［41］。至此，Brooks认为乳酸产生与氧耗之间只是一个统计学的“相关性”巧合，乳酸产生与氧气供应没有因果关系。乳酸产生既不需要“无氧”，也不需要“有氧”条件。乳酸堆积的最可能原因是乳酸清除障碍。2018年，Brooks在接受采访时说：“这是一个历史性错误。当时人们认为，当氧气不足时，肌肉中会产生乳酸。它被认为是一种疲劳剂，一种代谢废物，一种代谢毒物。当细胞处于压力时，会有大量乳酸产生，然后将其归咎于乳酸，这是经典的错误”［42］。值得注意的是，Brooks所说的“经典错误”，今天可能正在犯或经常犯，毕竟把运动的益处归功于或疲劳归咎于运动产生的“某种分子”是最简单且自然的看法。
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乳酸穿梭假说的创立
Brooks对乳酸-氧债假说的质疑具有充分的实验证据。1986年，他从实验数据中提出了比较完整的新学说——乳酸穿梭。Brooks的实验依据是：在持续且稳定运动中形成的乳酸大部分(75%以上）被氧化去除，只有一小部分(约20%)转化为葡萄糖。在活动的骨骼肌乳酸释放过程中，同时发生显著的乳酸摄取，乳酸总摄取量约为净释放量的一半。出现在血液中的乳酸大部分会被氧化型肌肉纤维和心脏清除。Brooks认为：“乳酸作为可氧化底物通过间质和血管，从糖原分解率高的区域穿梭到细胞呼吸率高的区域，似乎是一种重要方式。通过这种方式，底物被分配，代谢‘废物’被清除，各种组织的功能在运动中得到协调”［43］。这是他第一次对乳酸穿梭的轮廓进行描述。“在完全有氧的休息或运动条件下，乳酸的形成是不同组织共享一个碳源(乳酸)进行氧化或其他代谢(如糖异生)的重要机制。这种机制被称为乳酸穿梭”［44］。这是Brooks第一次定义“乳酸穿梭”，体现了整合生理学观点——乳酸不是某个细胞的代谢产物，也不仅仅是肌肉的产物，而是循环的乳酸，将各个器官、组织和细胞联系在一起。
Brooks随后对乳酸穿梭假说进行了充实和验证。在研究运动和恢复过程中的氨基酸和蛋白质代谢时，Brooks认为：许多氨基酸可转化为谷氨酸(通过谷氨酸脱氢酶)，然后转化为丙氨酸(通过谷丙转氨酶)。丙氨酸、乳酸和丙酮酸是糖异生的主要前体。通过糖异生，氨基酸可以提供碳源，维持运动过程中的血糖稳态和运动后的糖原恢复［45］。这一见解拓宽了乳酸穿梭的生理意义——乳酸穿梭是蛋白质（氨基酸）进入供能系统、维持血糖的重要桥梁。1988年，Brooks与其同事通过14C二次标记乳酸，估算运动过程中葡萄糖转化为乳酸的速率为0.65±0.16 mg/kg·min。在运动中，20%的葡萄糖被用于乳酸的形成，20%的血乳酸来自血糖，其余可能来自肌糖原［46］。尽管这些数据并非绝对参考值，受运动参数设置或检测方法的影响，但它为乳酸穿梭的深入描述提供了数据支撑。另外，如果真如“氧债”假说描述的，运动后氧耗旨在清除乳酸，那么外源性乳酸输入提高血乳酸，势必会影响运动后的耗氧量。但Brooks在1988年研究发现，诱导的乳酸血症不影响运动后耗氧量；控制运动血乳酸水平对恢复期摄氧量也没有显著影响［47］。这些发现进一步巩固了乳酸穿梭假说。
接下来的问题：乳酸是如何在细胞或组织之间穿梭的呢？1990年Brooks等研究发现，乳酸转运是由骨骼肌肌膜囊泡的膜结合载体介导的。乳酸转运蛋白是一种膜结合蛋白，与肌膜特异相关，表现出饱和性、竞争性、立体特异性、对温度和各种离子的敏感性［48］。大部分乳酸通过一种特定的载体介导穿过骨骼肌细胞膜，该过程在高乳酸浓度下是饱和的，但在细胞内低pH值下，未解离的乳酸被动地增加了转运。骨骼肌细胞膜中存在Na+/H+交换机制，影响乳酸和质子通量［49］。后来的研究证实，这些乳酸转运蛋白是单羧酸转运蛋白家族（MCT）的成员，除了转运乳酸，还转运丙酮酸、丙氨酸等单羧酸……这些成果也进一步巩固了乳酸穿梭的可能性。2018年，仍有研究对此高度评价：“即使关于乳酸膜转运体的研究呈指数型增长，Brooks和其同事的工作仍处于这一领域的前沿”［50］。
1991年，Brooks萃取了当时的大量实验数据，第二次对乳酸穿梭进行了综述，提出：乳酸在细胞、血液和器官之间的交换有很大用处，乳酸不是只在运动中积累的终端代谢物。内源性(糖原)和外源性(膳食)碳水化合物形成乳酸，是协调不同组织和细胞中间代谢的主要途径［51］。后人评价：“Brooks将对乳酸的认知从代谢废物转变为代谢中间物和重要的能量底物”这一突破性认识，为后乳酸时代的研究带来了新机遇［52］。Brooks提出了统一的乳酸穿梭假说，把以往乳酸交换各个方面的数据进行了整合，从而被不同学科领域一致接受。Brooks的乳酸穿梭假说没有局限于解释运动中的乳酸代谢，而是揭示了乳酸在机体代谢中的一般规律。运动肌肉中的乳酸穿梭不过是“穿梭”加快的一种特例。
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Crossover概念的创立
Crossover概念是Brooks解释“运动中糖与脂肪利用”而创立的另一假说。糖、脂肪、蛋白质是机体三大燃料和能量底物，但能量底物的分配受运动强度、性别、耐力训练和营养等多因素的影响，如何描述这种复杂的生理现象呢？Crossover尝试将这些因素的影响整合在一起，提出统一的能量底物分配模型。在静息条件下，脂肪是肌肉和整个身体主要的燃料。随着运动强度的增加，在运动肌肉中发生了一个转换(Crossover)，从依赖脂肪转为碳水化合物作为燃料来源。尽管蛋白质和氨基酸（如支链氨基酸）也会参与供能，但都不是肌肉重要的能量来源，可忽略不计。如果将血糖、游离脂肪酸利用率(Ra)和肌肉净糖原利用率作为相对运动强度（%VO2max）的函数，可以发现游离脂肪酸利用率(Ra)与血糖利用率的函数曲线在大约55% VO2max时发生交叉。在狗、山羊、人类和啮齿动物的实验中都有类似发现，因此Brooks认为：“不管身体大小或有氧能力，能量底物分配都会遵循55% VO2max这种交叉模式”［53］。按照Brooks的观点，55% VO2max似乎是一个跨越物种的生理常数。Crossover概念如图1所示。
根据Crossover概念，个体在任何时间点的底物利用取决于运动强度诱导的反应(增加糖的利用)和耐力训练诱导的适应(促进脂质氧化)之间的相互作用。到交叉点（55% VO2max）时刻，糖的利用率超过脂质的利用率，功率的进一步增加导致糖利用率的相对增加和脂质氧化的相对减少［54］。Crossover概念把当时文献积累的数据拢在了一起，因为当时运动生物化学已经兴起，运动中糖与脂肪的利用成为研究热点，积累了大量的数据，急需一种理论解释和统辖这些数据。Crossover在很大程度上解决了这一问题。当时文献包含的数据表明，低强度耐力运动(≤45%VO2max)以脂质为主要底物，高强度运动(>75% VO2max)以糖为主要底物。这与Crossover概念是十分吻合的。在Crossover概念下，有些明显矛盾的实验结果可以进行理论上的统一，即不能把所有的矛盾归因于实验对象和条件，应该在Crossover概念下给予通解。这是Brooks提出Crossover概念的初衷。毕竟科学研究的最终目的是从繁杂的研究结论中寻找一般规律。
1997年，针对有些学者的挑战与质疑，Brooks对Crossover概念进行了补充。Brooks特别强调：由运动强度决定的能量通量（energy flux）是决定运动中底物利用的主要因素。耐力训练、膳食和前期运动等因素在决定运动期间的底物利用方面起次要作用［53］。Brooks坚持认为Crossover的普适性。如果把血糖和肌糖原合并为碳水化合物的利用率，Crossover概念还可以简化为图2这种模式，即运动机体对糖和脂肪的利用在55% VO2max交叉，能源底物在55% VO2max运动强度时发生转换。由于当时实验对象（大鼠、小鼠、兔、猪、狗、禽类）的VO2max差异巨大，经常导致实验结果难以比较，甚至相互矛盾，所以Brooks认为：“Crossover概念很有价值，不仅客观描述了观察到的实验现象，还能把代谢率差异极大的物种、不同性别、年龄或训练状态受试者的能量代谢进行统一比较”［53］。Crossover概念其实揭示了不同物种、任意个体在运动过程中糖与脂肪利用的统一规律。这正是生理学家希望的普适性规律。
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关于Crossover的论战
Brooks提出55% VO2max交叉点作为Crossover概念的核心，旨在描述运动机体糖与脂肪利用的“万能定律”，自然免不了质疑和挑战。对Crossover提出明确反对的是美国学者Andrew R Coggan。1995年，他发表了一篇论文［55］，并在1996年美国运动医学学院(ACSM)的会议和报纸上，反复声明“No Crossover”。Coggan认为：“在训练有素的人身上没有发现Brooks提出的高强度运动中葡萄糖利用的‘Crossover’”。在高强度运动中，有训练者血糖利用率较低，即使运动的相对强度与未接受训练的状态相同。训练对象的高血糖似乎是由于葡萄糖利用率较低所致，而不是葡萄糖产生率较高。
Brooks为此发表2篇文章回应Coggan的质疑。1996年Brooks在一篇letter中写道：“根据Coggan的数据，运动过程中葡萄糖的产生和利用比休息时增加4~5倍，并且随运动的进行继续增加。就Crossover概念而言，有训练的和未受过训练的受试者都跨进了碳水化合物利用，葡萄糖动力学的数据呈现了底物利用的交叉现象”。Brooks还说：“虽然我们赞成有理性的人对Crossover的细节存在分歧，但我们相信有压倒性的证据支持Crossover概念”［56］。果然，随后在狗和山羊上获得的原始数据，以及在老鼠和人类身上发表的数据，都支持Brooks的Crossover概念［57］。1997年，Brooks在一篇综述的结尾部分，对Coggan的质疑再次给予了回应：“Coggan的反对仅仅意味着他不理解Crossover概念……他们得出的结论是，在高强度运动中，训练会导致FFA和总脂质氧化增加。这样的结果表明运动员比非运动员的代谢率更高，这并不是什么新鲜事。”“糖原的差异在定量上与乳酸积累有关，而与脂质氧化无关，而对糖原变化的测量并不能提供直接的信息。”意指Coggan论文的方法存在问题。最后，Brooks总结道：“Coggan没有提供任何证据证明高强度运动是由脂质作为主要的能量来源的。相反，他的报告中有几项数据印证Crossover概念，比如在中等和高强度运动中对碳水化合物的依赖。Coggan在衰老和耐力训练受试者运动中底物利用模式的结论站不住脚，这是他拒绝Crossover的直接后果。”［53］
Coggan在同一期杂志对Brooks进行了反驳。Coggan写道：“Crossover概念更强调绝对运动强度（55% VO2max）作为底物选择的决定因素，不能被认为是运动代谢中一个重要的新概念。相反，Crossover概念实际上防碍了对这一领域的理解。”［58］由于这一话题对运动生理学的重要性以及这一争议带来的不确定性，美国生理学会1997年安排了一场论坛。Brooks和Coggan在会议上进行了辩论，并在同一期杂志刊登了两人的上述文章［59］。
1998年，Brooks把乳酸穿梭引入Crossover概念的解释：Crossover和乳酸穿梭可以解释人类在运动中的底物利用，甚至扩展到其他哺乳动物物种。Crossover可以解释，随着运动强度从轻度增加到中高强度，燃料选择从对脂肪转变为对碳水化合物的依赖。乳酸穿梭可以解释，在高强度运动以及其他糖酵解加速的条件下，肌肉中糖酵解通量、乳酸形成与氧合状态无关。乳酸(不是丙酮酸)的形成、分布和代谢去路代表了持续运动过程中中间代谢调节的关键步骤［60］。Brooks认为，Crossover和乳酸穿梭可以解释包括人类在内的哺乳动物从低到高强度运动中底物利用的切换点。尽管Crossover的解释跟当时大部分实验数据是吻合的，但他把绝对运动强度作为能量底物选择的决定因素，认为年龄、性别、膳食、训练状态等因素都是次要的，这与特殊生理条件下的数据并不一致。后来研究也证实，机体对运动和外部条件的适应，可能改变从脂肪利用到糖利用的切换点，绝对运动强度（55% VO2max）并不准确。其次，Crossover对能源底物转换的解释比较粗犷，跟21世纪的“分子机制研究”距离遥远。为什么Crossover？这需要更多的分子依据。如果55% VO2max不具有普适性，Crossover描述的“交叉”现象就不具有新学说的生命力。
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乳酸穿梭的第一次飞跃——细胞内乳酸穿梭
虽然乳酸穿梭得到了学界的认可，但也有问题要解决。乳酸分子或离子如何在不同细胞和组织之间穿梭，如何氧化的？必须给出更深刻的解释。Brooks在1999年发表三篇实验论文深度刻画乳酸穿梭。心脏和骨骼肌线粒体有一个单羧酸转运蛋白MCT1。免疫标记和电子显微镜一致显示，MCT1与乳酸脱氢酶一起位于线粒体。Brooks的结论是：横纹肌线粒体中MCT1的存在允许线粒体乳酸氧化，并促进“细胞内乳酸穿梭”［61］。将离体大鼠肝脏、心脏和骨骼肌线粒体与乳酸、丙酮酸、谷氨酸和琥珀酸孵育，他们研究发现，在心脏LDH-1(H4)集中于线粒体，而LDH-5(M4)同时存在于线粒体及周围的细胞质和细胞器中。LDH-5在肝脏中占主导地位，但在线粒体中比其他区域更丰富。因为胞质乳酸超过丙酮酸浓度一个数量级，Brooks得出结论，乳酸是在体内被线粒体氧化的单羧酸。哺乳动物肝脏和横纹肌线粒体可以氧化外源性乳酸，线粒体内的LDH有助于乳酸氧化［62］。Brooks的思路大约如此：乳酸根离子进出脂质膜必须要有一个载体，而MCT1定位于线粒体；其次乳酸氧化必须先脱氢变成丙酮酸，线粒体又存在丰富的LDH。MCT1与LDH在线粒体的共定位，有力地支持了“细胞内乳酸穿梭”——即胞浆形成的乳酸可以在MCT1的帮助下进入线粒体，在线粒体LDH的催化下生成丙酮酸，重新接入三羧酸循环（见图3）。
在1999年的第三篇论文中，Brooks把“细胞内”与“细胞间”乳酸穿梭进行了统一。“细胞间乳酸穿梭”在乳酸产生和乳酸消耗细胞之间进行，“细胞内乳酸穿梭”可以发生在细胞内的隔室之间，线粒体是细胞内乳酸处理的主要场所，最终可以实现乳酸清除。因此，线粒体密度高的细胞(心肌细胞、红肌纤维、肝细胞)是参与乳酸清除的细胞。细胞内丙酮酸对LDH的Km为3.6×10-4 M，这个值很低，不管细胞内是否有氧，糖酵解都能产生胞质乳酸。因此，乳酸是线粒体氧化的主要单羧酸盐，并非之前一直认可的丙酮酸［63］。
2000年，Brooks完整阐述了细胞内和细胞外乳酸穿梭，进一步拓宽了乳酸穿梭假说。他认为，乳酸在各种组织和细胞间的能量分布中起着关键作用。细胞质和线粒体、肌肉和血液、活跃和不活跃的肌肉、白肌和红肌、血液和心脏、动脉血液和肝脏、肝脏和运动肌肉、肠道和门静脉血液、门静脉血液和肝脏、肝区、皮肤和血液之间，都是以乳酸的形式把糖的能量进行分配。乳酸在细胞膜上的转运是通过PH和浓度梯度易化扩散发生的，由单羧酸转运蛋白(MCTs)介导。除细胞膜，线粒体还含有单羧酸转运蛋白(mMCT)和乳酸脱氢酶(mLDH)。因此，线粒体单羧酸盐摄取和氧化，不是转运乳酸到细胞表面，而是调节体内的乳酸通量［64］。这是乳酸穿梭的一次飞跃，Brooks把乳酸穿梭拓展到全身各种组织和细胞间，细胞内乳酸穿梭是细胞间乳酸穿梭的最终归路。只有两者之间偶联才能完成乳酸氧化。但是这一论断也遭到了反驳，瑞典的运动生理学者Sahlin在他的研究中指出：“线粒体不能直接氧化乳酸，而且骨骼肌线粒体中的乳酸脱氢酶活性可以忽略，线粒体NAD+/NADH的高度还原状态使得线粒体基质中的乳酸氧化在热力学上是不可能的。”［65］
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乳酸穿梭的第二次飞跃——自然法则
2002年Brooks进一步提出，乳酸穿梭是自然界能量分布的通行法则。线粒体乳酸-丙酮酸转运体似乎与线粒体LDH协同工作，使乳酸在呼吸活跃的细胞被氧化。因此，线粒体的功能是建立细胞吸收和氧化乳酸所必需的浓度和质子梯度。细胞内乳酸穿梭的其他例子还包括乳酸在精子线粒体中的摄取和氧化，以及通过丙酮酸-乳酸交换促进过氧化物酶体中的β-氧化。酵母菌的线粒体中含有黄细胞色素b2，这是一种乳酸细胞色素c氧化还原酶，它将乳酸脱氢与细胞色素c的还原偶联在一起。因此，细胞间和细胞内的乳酸穿梭让Brooks产生了一种新概念，即糖酵解和有氧氧化途径可以被视为连接的供能系统，而不是非此即彼的替代过程，因为乳酸是糖酵解的产物，也是有氧氧化的底物［66-67］。这一认识，颠覆了运动生理学对三大供能系统的划分。乳酸穿梭在高等生物和低等生物中都存在，只不过是脱氢和还原的催化酶不同。从物理化学的本质看，乳酸穿梭都是把电子递向电负性高的电子载体，这一规则在生物界可能是普适性的。对于哺乳动物，线粒体承载这项工作，是乳酸穿梭呈现的特例，人体运动中的乳酸穿梭又是特例中的特例。Brooks再次揭示了生物界能量分布的一种普适性规律。
2007年，Brooks再次强调：乳酸是糖酵解和氧化代谢之间的中间产物。由于糖原分解和糖酵解的产物乳酸被氧化代谢处理，乳酸穿梭连接了细胞能量产生的两个主要过程。特别是运动过程中，乳酸氧化占清除的70%~75%，其余为糖异生［68］。2009年，Brooks第八次完善乳酸穿梭学说，与2000、2002年基本观点相同，但特别提出：乳酸与丙酮酸交换影响细胞的氧化还原状态，乳酸本身是一种ROS发生器［69］。从氧化还原角度建立的乳酸新角色拓宽了人们对乳酸的认识，2022年有学者对此评价：“乳酸穿梭更重要的贡献是，乳酸调节氧化和细胞间信号通信，揭示了乳酸在生物学上的一个全新的重要作用。”［70］
2010年，Brooks在接受采访时表示：“乳酸穿梭，大自然的运作方式。”［71］乳酸穿梭对运动生理学乃至生理学、医学有三点意义：第一，解释了乳酸与氧耗之间的关系。因为线粒体氧化乳酸需要消耗氧气，并非因为氧气不足导致乳酸产生，乳酸穿梭弥补了希尔“氧债”假说的缺陷。第二，深刻揭示了生物界能量分布的一般规律。乳酸穿梭为电子转移进行能量分配提供了一种通用机制，运动中肌肉需要更多更快速的ATP供应，但ATP不能直接递送，不能远距离输送，正是细胞内与细胞间的乳酸穿梭不断把碳源（电子载体）送到线粒体呼吸链，从而把各组织细胞的能量供应联络一体。在低等生物中也是同样的机制。第三，解释了肿瘤细胞有氧糖酵解。因为乳酸生成与氧无关，丙酮酸对LDH的Km很低，无论有氧无氧，胞质的丙酮酸更倾向于生成乳酸。正常组织细胞有强大的有氧代谢能力和乳酸穿梭，能够清除乳酸；而癌细胞则不能，表现有氧糖酵解生成乳酸的假象。总之，乳酸不是糖酵解的标志物，乳酸只不过是糖酵解和有氧氧化的中间产物，“抑制乳酸形成”会阻断大部分甚至全部的有氧氧化路径，把“抑制乳酸形成”作为抗癌策略不恰当。
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乳酸穿梭的第三次飞跃——能量代谢与信号的相遇
早在2000年Brooks就提出，“细胞-细胞”和“细胞内乳酸穿梭”的概念描述了乳酸在氧化和糖异生底物运输以及细胞信号转导中的作用。星形胶质细胞和神经元之间的乳酸交换与大脑中的谷氨酸信号传递有关，这是支持细胞-细胞信号传递的乳酸穿梭的一个例证［64］。乳酸穿梭从表面看是乳酸的跨膜转运，对细胞碳源综合调度，对能量统筹分配，但本质可能是跨膜信号转导，这是Brooks关于乳酸信号学说的一个雏形。
2018年，Brooks第九次刻画了乳酸穿梭，全面定义了乳酸的三重角色：(1)主要的能量来源，(2)主要的糖异生前体，(3)信号分子［72］。2020年，Brooks重申了这一观点，并特别指出：乳酸阴离子是在充分有氧条件下形成的，并在各种细胞、组织、器官和全身水平上持续利用。通过分解产能、细胞氧化还原调节、变构结合和组蛋白赖氨酸残基的乳酸化操纵染色质重编程，乳酸对能量底物分配有重要影响。组织乳酸的浓度范围为0.5~20 mM，细胞乳酸/丙酮酸比值(L/P)具有10~500的可变范围，在运动和其他压力-应激反应过程中，这些变化在量级和广度上使其他代谢信号相形见绌［73］。Brooks这一论断回答了本文开篇的问题：为什么乳酸如此备受关注？尽管运动产生的代谢物以及基因响应广泛，但在细胞内造成的“影响”以及波及范围，很少有物质能达到乳酸的量级——乳酸非常神奇地把“能量基质”“中间代谢物”与“信号分子”的角色统御一身，而结构还是简单的2-羟基丙酸，这对于运动生理学中的“分子”角色认知和再认知具有启示意义。
2020年，Brooks还回顾了自己发现和创立乳酸穿梭的曲折历史，并指出：乳酸穿梭适用于运动营养补水、酸中毒和登革热的复苏、创伤性脑损伤的治疗、维持血糖、减轻炎症、心力衰竭和心肌梗死后的心脏支持、提高认知能力等多个领域的生理学解释。然而，失调的乳酸穿梭破坏代谢灵活性，支持肿瘤的发生。癌症中的乳酸生成(Warburg效应)与所有主要的癌变后遗症有关，如血管生成、免疫逃逸、细胞迁移、转移和能量自给［74］。这已经超越对运动生理的解释，乳酸穿梭在更广泛的生理医学领域都能对生理或病理现象给予与实验吻合的解释，体现了乳酸穿梭的理论生命力。
2021年，Brooks讨论了心脏在乳酸穿梭中的作用。他在文章中指出：在乳酸穿梭的概念下，机体细胞可以分为乳酸生产者和乳酸消费者两类，运动驱动“生产者”细胞与“消费者”细胞之间的作用是显而易见的（见图3）。心脏内乳酸穿梭的存在可以解释心脏力学和代谢是如何同步的。收缩期血流中断是由糖酵解作用支持的（因为血氧运输不到，心肌乳酸清除受阻），舒张期血流恢复是由氧化代谢维持的［75］，这是乳酸穿梭在心脏生理中又一成功的解释。同年，Poole与Brooks等以“无氧阈:50多年的争议”为题回顾了乳酸简史，明确指出：氧不足不是乳酸血症的主要基础……使用气体交换阈值(CO2排放与摄氧量的非线性增加)对乳酸阈进行无创评估在运动训练和临床中仍然很重要，但应该根据乳酸穿梭来解释无氧阈这种生理现象［76］。Brooks不反对无氧阈、乳酸阈作为“实用工具”，但必须明确乳酸与氧耗无关。这是他50年前批判希尔的氧债假说就一直坚持的。
2022年，78岁的Brooks再次写道：“一个世纪过去了，是时候翻开乳酸代谢的新篇章，认识到乳酸穿梭是体内中介代谢的重要组成。细胞细胞和细胞内乳酸穿梭实现能量底物的生产和分配以及细胞信号传递。定期锻炼中细胞反复摄入乳酸会产生适应性过程，如线粒体生物发生，提高体力工作能力、代谢灵活性、学习和记忆……乳酸在21世纪的生物学中已经上升到重要地位。”［6］这是Brooks第15次回顾他的乳酸印象。美国康涅狄格大学的Langan博士对这篇文章给予高度评价：“由于Brooks的毕生贡献，乳酸的含义已经远远超过早期的设想。科学中最有趣的认识就是，曾经被认为是教条的东西，可以通过创造性的思维、对基本原理的坚定理解和实验室技术的进步而被推翻。”［77］
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结语
本文的目的是站在唯一研究者的视角，探讨运动生理学家认识“分子”的思路和方法，Brooks和乳酸只是作为一个案例。从希尔算起，运动生理学走过110多年，Brooks专注乳酸研究50余年，累计发表15篇以乳酸为题的综述论文，创建并发展了乳酸穿梭学说。Brooks之后是否还有新学说，乳酸穿梭是否会被新的学说颠覆，目前不得而知。这一百年来，乳酸还是乳酸，但科学家的认知和观点前后不一，这表明科学探索永无止境。但从应用价值出发，这对于运动训练、肿瘤治疗和健康促进都是不利的。Brooks的乳酸简史为我们勾画了一条认识“分子”的通路：运动的本质是加快物质代谢（电子传递）进行组织或细胞之间的能量分配，但代谢物扮演的角色不局限于代谢，必定有一种机制把代谢物的浓度变化转换成信号的强弱。运动终究会改变一批基因与蛋白的表达，改变一批代谢物的浓度，似乎还是不可重复的。定义一个分子或代谢物的“好”与“坏”，对生理学而言可能并没有什么意义，甚至会将转化应用导入歧途。氧债假说创立与颠覆表明，过度宣传一项研究结果或一篇论文，并不利于后继者站在客观角度进行科学探索。从运动生理的特殊性或极端性中走出来，构造一种普适性机制，才能解释和统辖前后矛盾的实验数据，创造有生命力的生理学说。
参考文献：略
基金信息：国家自然科学基金项目（32271174）。