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陈佳点评 | Cell里程碑：碱基编辑「最后一块拼图」，新技术TALED来了
4月25日，最新发表在Cell杂志上的一项研究中，来自韩国的一个科学家团队带来了碱基编辑领域的一项里程碑进展[1]。他们开发了一种名为TALED（transcription activator-like effector-linked deaminases）的碱基编辑器，实现了线粒体基因组中A-to-G的碱基转换。TALED被认为是碱基编辑技术中缺失的最后一块拼图，有望带来遗传性疾病治疗的新突破。
来源：Cell
众所周知，DNA由4种碱基——A（腺嘌呤）、T（胸腺嘧啶）、C（胞嘧啶）、G（鸟嘌呤）——组成；根据碱基互补配对原则，A与T配对、C与G配对。点突变是指由单个碱基改变引发的突变，可分为转换和颠换两类。转换是指嘌呤与嘌呤之间，或嘧啶和嘧啶之间的替换；颠换则是指嘌呤和嘧啶之间的替换。其中，转换突变几乎占所有疾病相关点突变的三分之二，一些这类突变导致了迄今为止还没有治疗手段的严重疾病。
2016年4月，发表在Nature上的一篇论文中，基因编辑领域大牛David R. Liu带领的团队首次报道了能够将细胞核DNA中C转变为U（U通常存在于RNA中，在DNA中细胞会把它当作T来阅读）的、基于胞嘧啶脱氨酶APOBEC1的碱基编辑技术；也就是实现C•G碱基对向T•A碱基对的转换[2]。
在实现了C•G向T•A的转换后，科学家们进一步想到要开发A•T向G•C转换的技术。仅相隔半年，David R. Liu团队就实现了这一突破。他们在2016年10月发表于Nature杂志上的另一篇论文中，报道了可实现T•A向C•G转换的基于TadA酶突变体的新型碱基编辑技术ABE（Adenine Base Editor）[3]。
在实现了细胞核DNA的自由碱基编辑后，科学家们把目光转向了线粒体DNA (mtDNA)。2020年7月，David R. Liu及其合作伙伴带来了另一项突破：他们开发了能够实现线粒体DNA碱基编辑的工具——DdCBE（DddA-derived cytosine base editors）。DdCBE可以实现线粒体DNA的C-to-T转换，即让C•G碱基对转换为T•A碱基对[4]。
尽管线粒体DNA仅编码10多种蛋白质，但所有这些蛋白质都与细胞的能量供应有关，因此，线粒体DNA 突变导致了人类一系列可能致命的代谢相关遗传性疾病，如会导致双眼突然失明的Leber遗传性视神经病变(LHON)，会慢慢破坏患者大脑、伴有乳酸酸中毒和卒中样发作的线粒体脑肌病(MELAS)。一些研究甚至表明，线粒体DNA的异常也可能是阿尔茨海默症和肌肉萎缩等退行性疾病的原因。
目前已知的致病线粒体DNA点突变有90种左右，先前开发的用于细胞核DNA碱基编辑的技术因递送方面的障碍无法用于编辑线粒体DNA。具体来说，先前可对细胞核中的DNA进行有效碱基编辑的胞苷脱氨酶通常只能作用于单链DNA，因此，必须依靠Cas9酶来破坏双链DNA，创建一个未缠绕的单链DNA区域才能发挥作用，而Cas9酶需要guide RNA的引导，但这类RNA无法进入线粒体中（细胞本身缺乏这种机制）。
在2020年的这篇论文中，科学家们找到了可以直接作用于双链DNA，不再依赖Cas9酶的胞苷脱氨酶DddA，该酶可催化胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(U)。DddA的一个显著特点是它能够靶向双链DNA，而在此之前被发现的胞苷脱氨酶均只能靶向单链DNA。DddA不会诱导双链DNA断裂的特点使其非常适合用于编辑线粒体DNA，因为线粒体缺乏修复双链 DNA 断裂的有效机制。
在基于DddA的DdCBE技术实现了线粒体DNA C-to-T的转换后，留给科学界的下一个难题就是，开发实现线粒体DNA A-to-G转换的碱基编辑技术，这非常关键，因为DdCBE技术主要局限于TC基序，尽管是有效的TC-TT转换器，但它只能纠正10%（9个）已被证实的致病线粒体点突变。
在最新发表于Cell杂志上的论文中，Sung-Ik Cho等科学家们终于破解了在线粒体DNA中实现A-to-G转换的难题。具体来说，他们融合三种不同的组件创造了TALED（transcription activator-like effector-linked deaminases）技术。第一个组成部分是一个转录激活子样效应器(TALE)，它能够靶向DNA序列。第二种成分是TadA8e，一种促进A-to-G转换的腺嘌呤脱氨酶。第三种成分DddAtox是一种胞嘧啶脱氨酶，其作用是使DNA更容易被TadA8e编辑。
“以前没有人想过使用TadA8e对线粒体进行碱基编辑，因为在先前的认知中，它只针对单链DNA。正是因为跳出了这种‘固定思维’帮助我们发明了TALED。”领导该研究的Jin-Soo Kim说道。
在TALED技术中，之所以TadA8e能够对线粒体双链DNA (dsDNA)执行A-to-G的编辑，是因为DddAtox提供了至关重要的帮助。研究人员推测，在DddAtox帮助瞬时解开双链DNA的短暂时间窗口内，TadA8e快速地进行了必要的编辑。
TALE融合腺嘌呤脱氨酶（TALE-fused adenine deaminases）诱导人线粒体DNA的A-to-G编辑（来源：Cell）
通过调整TALED的组成部分，研究人员还开发了可同时实现A-to-G 和C-to-T碱基编辑的技术。
TALED在人类细胞中非常高效，在各种线粒体基因中共17个目标位点催化A-to-G转换的编辑频率高达49%。安全性研究显示，TALED既未显示细胞毒性，也未导致线粒体DNA的不稳定性。脱靶方面，TALED未对细胞核DNA产生不想要的脱靶编辑，在线粒体DNA中也极少有脱靶效应。
在人类线粒体DNA中进行A-to-G转换，可以纠正43%（39种）已知的致病突变。接下来，研究人员的目标是提高编辑效率和特异性以进一步改善TALED，最终为纠正胚胎、胎儿、新生儿或成年患者的致病线粒体DNA突变铺平道路。
总结来说，研究者们认为，TALED极大拓宽了线粒体基因组编辑的边界，将在构建线粒体疾病动物模型以及疗法开发方面发挥至关重要的作用。
正序生物 联合科学创始人
陈佳教授
陈佳教授，正序生物科学创始人之一，上海科技大学生命科学与技术学院教授、基因编辑中心主任。美国国立卫生研究院博士后，中科院上海生化细胞所博士，南开大学生命科学学院学士。陈佳教授的研究聚焦于基因编辑工具开发与应用、DNA修复机理及癌症生物学领域，多项研究成果发表在Nature Biotechnology, Nature Structural & Molecular Biology、Nature Cell Biology等国际知名学术期刊上，应邀为Cell, Nature Biotechnology等国际知名学术期刊撰写综述、评论，并受到Cell, Science等杂志专访。
医药魔方Pro：最新发表在Cell杂志上的这项研究进展取得了怎么样的突破？
陈佳教授：这项研究进展极大拓展了线粒体基因（mtDNA）的编辑范围。目前人类线粒体相关的95个临床确证致病突变中，有90个是点突变造成。由哈佛大学David Liu教授团队开发的DdCBEs碱基编辑器实现了mtDNA中C-T的转换，仅适用于T-C（A-G）突变的修复，这类临床确证的致病突变仅占90个点突变中的10%，应用范围受限。韩国基础科学研究所（IBS）Jin-Soo Kim教授团队开发的TALED碱基编辑器则实现了人类mtDNA中A-G的转换，效率最高可达49%，将有望修复线粒体致病点突变中39/90的C-T（G-A）突变。这不仅填补了mtDNA编辑领域的空白，还可针对在细胞系和动物体内产生的mtDNA突变创建疾病模型，为修复患者的致病mtDNA突变铺平了道路。
医药魔方Pro：开发实现线粒体基因组中A-to-G转换的碱基编辑技术，先前主要的瓶颈是什么？
陈佳教授：先前的主要瓶颈在于两方面，一方面是无法将CRISPR系统中的gRNA有效地导入线粒体中，另一方面是TadA脱氨酶只能够催化单链DNA上A至I的脱氨反应。Jin-Soo Kim团队将转录激活子样效应器（TALE）、来自伯克霍尔德氏菌Burkholderia cenocepacia中催化受损的DddAtox变体、以及工程化腺苷脱氨酶TadA结合，构建了线粒体编辑工具包TALEDs。TALEDs利用TALE作为定位子靶向线粒体DNA并利用催化受损的DddAtox变体产生单链DNA，巧妙地克服了以上两个问题，从而实现了线粒体中的A-G碱基编辑。
医药魔方Pro：您是在何时、因何机缘开始从事碱基编辑相关研究的？能否分享1-2项最近的研究成果？
陈佳教授：在美国国立卫生研究院做博士后时，我主要研究DNA损伤修复。回国开展独立研究工作后，我们从分子机理入手，利用CRISPR作为工具研究DNA损伤修复，并且发现胞嘧啶脱氨酶APOBEC能够在nCas9诱导的DNA单链断裂修复过程中产生随机性C-T碱基突变。恰好，一种新的基因编辑技术Base Editor出现了，并且和我之前在DNA损伤修复领域的研究工作非常契合，就开始了碱基编辑领域的探索。目前，在实验室团队和合作伙伴共同努力下，我们已开发出了5大系列、近20种碱基编辑器，包括最新的高精准变形式碱基编辑器（transformer Base Editor, tBE）。这些研究成果已经发表在Nature Biotechnology、Nature Structural & Molecular Biology、Nature Cell Biology等国际学术期刊上。
最近，我们正在研究如何优化现有的导向编辑系统（Prime Editor，PE）。PE目前能够介导的DNA插入片段较短、在很多疾病相关位点编辑效率很低、在人类细胞中是否会产生脱靶效应等问题制约着其在临床中的应用和推广，我们希望可以开发出能效更高的PE系统，将PE系统在疾病相关靶点的编辑效率真正提高到成药水平。通过规律性引入同义突变和pegRNA骨架优化，我们开发了新型导向编辑系统sPE和aPE，优化的sPE系统将碱基转换效率平均提高353倍（最高至4976倍），优化的aPE系统将碱基插入/缺失效率平均提高了2.77倍（最高至10.6倍）。该项研究成果近日发表在国际学术期刊Nature Communications[5]。
医药魔方Pro：碱基编辑疗法目前总体处于怎样的开发阶段？有哪些挑战亟需克服？
陈佳教授：碱基编辑器最早于2016年由David Liu教授团队研发，尽管只有6年的发展历史，但因其填补了经典的Cas9技术无法涉及的空白领域，可以在无需产生DNA双链断裂的情况下实现单个碱基的精准编辑，一经问世就备受关注。目前，已经报道的新型碱基编辑系统包括C-to-T碱基编辑器（BE4max）、A-to-G碱基编辑器（ABE8e）、可以在线粒体中实现C-to-T编辑的胞嘧啶碱基编辑器（DdCBE）、最新Cell论文提出的在线粒体中实现A-to-G编辑的TALED；以及REPAIR、RESCUE等RNA编辑器。
碱基编辑系统发展到现在，需要优化的方面主要包括降低脱靶活性、扩展靶向范围、提升体内编辑和递送效率等。正序生物的科学创始人团队创建了全基因组和全转录组范围内均无脱靶效应的新型高精准碱基编辑器tBE，利用双AAV递送系统在小鼠体内实现了精准高效的体内编辑。相比其他的碱基编辑技术，tBE在控制脱靶效应和提高体内编辑效率方面具有显著的优势。
医药魔方Pro：正序生物在碱基编辑疗法方面进行了怎样的布局？展望未来3-5年，您对碱基编辑疗法的发展有怎样的期待？
陈佳教授：正序生物正在搭建一套完整的碱基编辑疗法的研发、生产、质控体系，全面布局碱基编辑疗法相关创新研究成果的技术转化与应用。在管线进展方面，依托科学创始人团队开发的多种精准基因编辑疗法，正序生物正在全力推进第一条IND管线，将尽快推进至IND申报，同时并行研发数条遗传类、代谢类、肿瘤免疫类和传染病类治疗领域的多元化管线。值得一提的是，正序生物在上海高等研究院和张江细胞产业园的研发和生产中心即将在今年陆续落成，位于北京华贸的临床注册和运营中心也即将运营，我们将以世界一流的标准打造R&D实验室、CMC工艺开发实验室、cGMP生产车间等，保障创新研究成果的快速转化与应用。
相信在不远的将来，碱基编辑疗法必将成为攻克人类严重疾病的精准基因编辑治疗药物，帮助患者解除病痛。正序生物期待以新型基因编辑系统-碱基编辑为基础，快速推进突破性精准基因疗法在疾病治疗中的应用，实现以创新基因编辑技术造福全人类的美好愿景。
[1] Sung-Ik Cho et al. Targeted A-to-G base editing in human mitochondrial DNA with programmable deaminases. Cell(2022).[2] Alexis C. Komor et al. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature(2016).[3] Nicole M. Gaudelli et al. Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature(2016).[4] Beverly Y. Mok et al. A bacterialcytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing. Nature(2020).[5] Xiaosa Li et al. Highly efficient prime editing by introducing same-sense mutations in pegRNA or stabilizing its structure. Nature Communications(2022).
参考资料：1# A new era of mitochondrial genome editing has begun(来源：Institute for Basic Science)2# Gene-editing hack yields pinpoint precision(来源：Nature)3# Precise DNA editing made easy: New enzyme to rewrite the genome(来源：Howard Hughes Medical Institute)4# Mitochondrial genome editing getsprecise(来源：Nature)5# Scientists make precise gene edits to mitochondrial DNA for first time(来源：Nature)
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