新型蛋白降解技术NanoTAC 来了！与PROTAC相比，有何不同？

降解剂介导的靶蛋白（protein of interest，POI）下调为探索尚未成药的蛋白质组提供了机会。相比传统的PROTAC技术（通过与E3泛素连接酶和靶蛋白形成三元复合物来发挥降解作用），标签靶向蛋白降解剂（tag-Targeted Protein Degrader，tTPD）有着独特的作用机制，如dTAGs通过识别FKBP12^F36V而不是靶蛋白来发挥降解作用，HaloPROTACs通过识别HaloTag7调节靶蛋白丰度，因此，tTPD已成为蛋白降解领域备受关注的潜力工具，有望通过更改标签大大扩大可降解蛋白的范围。

近日，来自墨尔本大学医学生物学系的研究团队开发了一种具有催化活性的蛋白降解剂NanoLuc靶向PROTAC（NanoLuc-targeting PROTACs，NanoTACs），可以通过“劫持”CRBN复合物降解NanoLuc荧光素酶标签底物。这项研究扩充了tTPD工具箱，并且对dTAGs、HaloPROTACs和NanoTACs三种方法进行了详细的对比。相关研究于4月19日发表在Nature Communications杂志上。

研究团队通过慢病毒转导技术在HEK293T细胞中稳定表达了一种tTPD通用报告蛋白Halo-EGFP/Firefly-NanoLuc-FKBP^F36V，可以同时对比NanoTACs、dTAGs与HaloPROTACs的降解能力。

Halo-Firefly-NanoLuc-FKBP^F36V结构（来源：Nature Communications）

dTAG是一类将FKBP12^F36V配体与免疫调节剂 (Immunomodulatory drugs，IMiDs)通过连接基团结合形成的异质双功能分子，可以实现FKBP12^F36V融合蛋白的有效降解。然而，POI标记FKBP12^F36V方法有限，且标记效率低，限制了这项技术的应用。

2015年，PROTAC领域鼻祖Crews等将 Promega公司开发的HaloTag（HT）技术引入PROTAC，开发了HaloPROTAC系列化合物。HT是一种工程化细菌脱卤酶，可以与氯化烷烃共价结合。HaloPROTAC由VHL配体与氯化烷烃结合，可诱导HT融合蛋白的降解。但是相对于其他标签，HT分子量较大；共价结合不利于HaloPROTAC发挥催化降解效能。

NanoLuc分子量为19 kDa，是一种可以生物发光的蛋白质标签，稳定性好、体积小，具有良好的生物相容性。NanoTACs是将NanoLuc抑制剂与E3连接酶配体结合，利用复合物触发NanoLuc标记的POI降解。相对于蛋白印迹实验（Western blot，WB）信号输出，生物发光信号的灵敏度更好，可以更敏锐地捕捉蛋白水平变化。

三种tTPD结构图（来源：Nature Communications）

研究人员针对3种技术分别合成了多种化合物，用于评估各种方法的性能。

化合物命名及各自结构（来源：Nature Communications）

蛋白降解剂量滴定实验结果表明，基于CRBN的NanoTACs系列分子中，NC1和NC2分别在500 nM与1 μM使POI部分降解。NC3、NC4、NC5中采用了与NanoLuc亲和力更强的配体。因此，NC3与NC4降解效能显著优于前者，其中又以NC4性能最佳。有趣的是，NC5连接基团仅比NC4少一个碳原子，却无法触发蛋白降解，原因可能是诱导POI降解功能必需的三元复合物处于不利构象。实验中，两种基于VHL设计的NanoTACs分子都不能诱导POI降解。

时间依赖性降解实验表明，NC4可迅速启动POI降解（约2 h），降解活性可持续至10 h。尽管经过CRBN配体修饰后，NanoTACs中NanoLuc配体对其亲和力降低，NC4仍可在约30 nM启动融合蛋白的降解。重要的是，利用蛋白质组学对细胞中5591种蛋白进行分析，没有观察到脱靶效应。

对比三种不同的技术发现，基于HaloTag技术设计的HV1与HV2化合物降解融合蛋白程度最低，可能是由于HT分子量太大以及共价结合不利于化合物发挥催化降解效能。靶向VHL的dTAG化合物FV1在相同浓度下均达到了最大程度降解。相较于FV1明显的剂量依赖性，NC4在高浓度出现的钩状效应，在使用中必须严格控制剂量。

FKBP^F36V降解融合蛋白性能优于其他tTPD系统（来源：Nature Communications）

总的来说，这三种tTPD技术都具有可逆降解POI的前景，方法均具有良好的特异性。然而，每种技术都有各自的优缺点，研究人员需要根据应用场景选择合适的POI标签。

三种tTPD技术优缺点对比（来源：NatureCommunications）

这篇论文中，研究人员开发了一种新型NanoTACs降解系统和一种通用报告蛋白。这种通用报告蛋白可以快速比对不同的tTPD系统中可更换的降解剂/标签对，能够有效丰富tTPD工具箱。需要注意的是，实验中还未开发出有效的识别VHL的NanoTACs降解剂，可能会限制这一技术的应用范围。

点亮“在看”，好文相伴