新型冠状病毒感染的免疫记忆性
COVID-19是一种由呼吸道病毒感染引起的呈全球流行的传播性疾病。截至2022年6月25日，全球有超过5.4亿人确诊感染，累计死亡人数超过632万。基于检测的局限性，实际感染人数及死亡人数可能远不止如此，造成了严重的经济社会负担，给各国公共卫生安全带来严峻挑战。尽管COVID-19在大多数情况下表现为轻症或无症状，但对老年人、婴幼儿及伴有慢性基础疾病的患者仍构成极大威胁。引起COVID-19的病原体是新型冠状病毒(SARS-CoV-2)，患者恢复后体内是否能够产生持久免疫保护力是防控的关键因素之一，而获得持久免疫保护力的核心在于机体是否能获得免疫记忆。
当病毒感染后，机体产生适应性免疫应答，包括T、B细胞的识别、活化、扩增及分化成为不同的效应细胞，通过特异性抗病毒免疫应答清除病毒后，部分效应细胞转变为记忆性细胞，使得机体对于同一病原体的再次刺激产生了免疫记忆性。病毒感染机体后获得的免疫记忆性主要依赖于适应性免疫的3种细胞：B细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞。其中，B细胞主要负责产生抗体，CD4+T细胞主要发挥辅助性或调节性作用辅助免疫记忆性的产生，CD8+T细胞主要负责特异性清除被感染的细胞。此外，还有其他免疫细胞及分子参与COVID-19免疫记忆性。在以往一些病毒感染中，机体能够产生持久的免疫记忆性及保护力，例如机体对于黄热病毒的免疫记忆性能够持续长达75年，对于麻疹病毒和脊髓灰质炎病毒的免疫记忆性能够维持65年和40年。尽管SARS-CoV-2感染发生的时间仅仅2年多，但对其免疫记忆性认识取得了显著进展，下面将针对B、T细胞及其他免疫细胞分别讨论SARS-CoV-2感染的免疫记忆性(图1)。
一、B细胞的免疫记忆性
COVID-19患者在愈后超过1年的恢复期内，其体内仍能检测到产生中和效价抗体的记忆性B细胞(memory B cells, Bm)，提示B细胞免疫记忆性在SARS-CoV-2感染后是存在的，发挥重要抗病毒保护作用。
1．生发中心(germinal center, GC)内的Bm
B细胞免疫记忆性是评价疫苗接种或感染后获得免疫力的重要标志，是产生持续保护性抗体的关键。特异性Bm只占所有B细胞的0.008%~0.1%。病毒感染并获得Bm的过程中，有效及持续的体液免疫应答主要出现在GC。在GC中，B细胞发生特异性克隆增殖、体细胞高频突变及抗体亲和力成熟，产生特异性Bm库及浆细胞。在这个过程中，GC中滤泡辅助性T细胞(Tfh)提供关键生长与分化信号，促进B细胞活化并介导体细胞高频突变及B细胞克隆的阳性选择，产生高亲和力Bm。
就SARS-CoV-2感染而言，有研究证实感染导致Bcl-6+Tfh细胞及GC显著增加，这将有助于Bm持续产生。针对SARS-CoV-2感染的长寿命Bm细胞在体内发挥作用的时间超过8个月，可有效保护机体不被再次感染。体细胞高频突变会在特异性Bm可变区中存在持续累积及产生亚型的转变。然而，重症感染后可能会损伤GC中Tfh细胞、Bm细胞的生成以及持续体液免疫力的维持，提示在重症患者康复后可能具有相对较弱的免疫记忆性。
进一步检测Bm亚型发现，恢复期20 d后IgM+Bm绝对数量显著增加，但随后转变为以IgG+Bm亚型为主，并且该亚型在恢复期150 d仍能显著增加。深入研究发现，SARS-CoV-2特异性IgG+Bm主要是CD27+且与循环Tfh细胞密切相关。这里需要特别指出的是，B细胞总数比例在SARS-CoV-2感染恢复期逐渐下降至正常水平。但是，特异性Bm绝对数量显著增加且能保持数月以上。
2．GC外Bm
在SARS-CoV-2感染中，除了GC内B细胞活化并分化为Bm，研究表明GC外也能产生短寿命浆细胞、长寿命浆细胞以及Bm。其中，血液循环和外周淋巴器官存在的短寿命抗体分泌细胞(antibody-secreting cells, ASCs)是恢复期数周到数月中和抗体产生与维持的主要Bm。而更长时间的免疫保护力则依赖于长寿命ASCs和Bm。短寿命浆细胞在感染初期分泌特异性结合受体结合域(receptor binding domain, RBD)的IgA抗体，其水平在3个月后显著降低，提示IgA+短寿命ASCs并不负责SARS-CoV-2感染康复后长久的免疫保护力。
3．针对中和表位的Bm
SARS-CoV-2血清特异性中和抗体水平是评价疫苗接种有效性或感染后机体免疫保护力的重要标志指标，因此，了解SARS-CoV-2中和抗体意义重大。在核酸检测确诊感染后6 d，就能在血清中检测到针对病毒的特异性中和抗体。然而，血清总抗体水平在进入感染恢复期随着时间延长而逐渐显著下降，这反映抗病毒感染完全清除后逐步恢复免疫静息。但是在症状出现后的240 d，仍能够检测到针对SARS-CoV-2 RBD和核衣壳(nucleocapsid, N)蛋白的特异性抗体，表明以体液免疫应答为主的免疫记忆性通过持续不断产生循环中和抗体，使得机体具有持续抗病毒免疫保护力。还有研究表明，中和抗体在SARS-CoV-2感染1年后仍能被检测出来。
(1)针对RBD的Bm
研究证实，SARS-CoV-2的中和位点主要集中在刺突蛋白的RBD，这是由于RBD是病毒结合宿主细胞受体血管紧张素转化酶2的主要结合部位。无论是轻症还是重症COVID-19患者，其恢复期都能产生持久且针对RBD的特异性Bm细胞，并持续超过1年以上。产生针对RBD中和抗体的Bm主要是IgG+和IgM+，而不是IgA+。而针对RBD的Bm几乎都表达CD27分子，并且与循环Tfh具有显著的相关性。其他病毒感染研究发现，与CD27-Bm比较，CD27+Bm会有更多的体细胞高频突变和细胞分裂。CD21lowCD27+Bm在其他病毒感染后会活化，但在2周后很快出现下调。CD21+CD27+Bm是处于静息状态的Bm。当再次遇到RBD，Bm能够迅速上调表面分子包括CD80、CD180和CD267，促进细胞的活化及中和抗体的产生。
(2)针对N蛋白的Bm
SARS-CoV-2的N蛋白含有丰富的中和表位，是特异性中和抗体的重要结合位点。在一项针对26名COVID-19患者康复后4~242 d的研究中，采用流式标记RBD和N蛋白检测血清，结果发现均能检测到针对RBD和N蛋白的特异性抗体。这些特异性抗体水平在症状出现20 d后开始下降，但在150 d仍能够检测到具有保护力的中和抗体，提示感染恢复后能够产生长时间的N蛋白特异性中和抗体。与针对RBD不同的是，针对N蛋白的Bm不表达CD27。
(3)针对其他抗原的Bm
除了上述两个抗原结合靶点，其他蛋白质如非结构蛋白(nonstructural protein，NSP)2、NSP3、NSP12~NSP14和开放读码框(open reading frame，ORF)3a~ORF9等亦是刺激机体产生B细胞免疫记忆性的重要抗原来源，丰富了Bm的多样性。但与上述RBD和N蛋白富集中和表位相比，这些抗原中和表位明显较少。
4．浆细胞免疫记忆性
在出现症状后14 d，浆母细胞数量显著增加，但到20 d即恢复期，浆母细胞消失，提示浆母细胞在SARS-CoV-2感染中只是短暂的扩增。该发现在以往流感病毒及登革热病毒感染中也有报道，提示由浆母细胞分化的浆细胞在随着感染的清除逐渐消失，并不参与机体针对SARS-CoV-2感染恢复后产生的长期免疫记忆性。研究显示，其他病毒感染中会出现不一样的情况，如流感病毒研究中发现浆细胞作为长寿命的ASCs能够提供一定的免疫记忆性。
5．仍需证实的肺组织特异性Bm
除了在循环系统中，Bm细胞在肺组织中可能同样发挥重要作用。例如，肺组织中存在流感病毒特异性Bm，能有效保护机体不被再次感染。但是，肺组织中SARS-CoV-2特异性Bm是否存在及其作用尚不清楚。但是，系统性Bm的建立，将可能通过募集到达呼吸系统，有助于保护机体避免再次感染的发生，或者即使出现感染也只发生轻症或无症状。以往针对流感病毒的小鼠感染实验表明，T-bethighBm主要出现在肺组织中，而T-betlowBm主要存在于外周血液循环中，提示T-bet对于Bm的组织特异性可能产生重大影响。
6．交叉反应性Bm
研究发现季节性冠状病毒Bm发挥了早期抗SARS-CoV-2的交叉反应，所以交叉反应性Bm也是SARS-CoV-2感染中B细胞免疫记忆性重要组成部分。其他病原体感染是否也产生针对SARS-CoV-2的交叉中和保护作用，仍有待进一步证实。在健康志愿者外周血中发现针对SARS-CoV-2 RBD的特异性IgM+或IgD+Bm，可能与以往接触过冠状病毒感染有关，再次证实针对SARS-CoV-2存在交叉反应。
二、T细胞免疫记忆性
在病毒感染出现症状的2~4 d，机体中就能检测出病毒特异性CD4+T淋巴细胞。病毒被清除后，大部分增殖的特异性T细胞凋亡，只有5%~10%分化为记忆性T细胞(memory T cells, Tm)并长期存活。Tm对于维持机体的持久抗病毒免疫保护力至关重要。近期研究发现，在2002—2004年严重急性呼吸综合征冠状病毒( SARS-CoV)感染后恢复的个体中仍能检测到血液特异性Tm，但未检测到中和抗体及Bm，提示Tm在维持长时间抗病毒感染免疫记忆性的作用中可能比Bm更为重要，也为认识SARS-CoV-2感染获得的长期免疫记忆性特征提供了有益借鉴。
1．Tm的亚型及特征
T细胞在抗病毒免疫应答后，形成不同亚型Tm，针对再次感染同一病毒时能迅速激活特异性抗感染细胞和体液免疫应答，实现对再次感染的迅速控制。其中，Tm主要是通过两方面实现免疫记忆性，一方面通过CD4+Tm迅速辅助体液免疫应答产生中和抗体，另一方面通过将CD8+Tm活化为细胞毒性T淋巴细胞对被感染的宿主细胞产生直接杀伤作用。Tm具备的特征包括：(1)显著增加针对特定病原的Tm库；(2)引起更快、更强的抗感染免疫应答；(3)唤醒特异性Tfh细胞，促进体液免疫应答在内的特定效应细胞；(4)组织常驻记忆性T细胞(resident memory T cells, Trm)迅速阻止同一种病原体的再次感染。此外，由于持续的感染或严重的炎症都会导致T细胞耗竭，进而损害T细胞免疫记忆性，这在重症或长时间感染中需特别注意。
CD4+Tm经CXCR5、ICOS、CD40L及多种细胞因子的分子互作而迅速活化Bm。而SARS-CoV-2特异性CD4+Tm(即Tfh细胞)也能够显著表达上述关键分子而促进针对刺突蛋白的Bm迅速增殖活化。这类SARS-CoV-2特异性CD4+Tfh细胞还能通过分泌Th1型和Th17型细胞因子增强免疫记忆性。在病毒感染早期，Th17细胞能够转化为Th1细胞。而循环Tfh(cTfh)细胞通过分泌IFN-γ和IL-17促进抗体类别转换为IgG。
2．Tm识别SARS-CoV-2抗原
检测恢复期COVID-19患者发现，在SARS-CoV-2的24种蛋白质抗原中，有21种存在特异性T淋巴细胞免疫应答，而无免疫应答的3种蛋白质可能与含量太少有关。在这些病毒蛋白中，刺突蛋白、膜蛋白和N蛋白是T细胞识别的主要抗原。此外，ORF3a和NSP3是另外两个重要的T细胞特异性结合靶点。在这些结合抗原中，有超过50% MHCⅡ限制性CD4+T细胞所识别的表位位于刺突以外的部位。这些Tm能够在IL-7和IL-15的协助下，不依赖于抗原刺激而长期存活。
3．循环Tm
恢复期COVID-19外周血液循环中Tm包括CXCR5+Tfh细胞、CXCR3+CD4+显著增加，而产IFN-γ的CD8+T细胞亦明显增多。在其他病毒感染恢复期，也发现了类似的循环Tm的显著升高。
4．Trm
特异性免疫记忆性T淋巴细胞对于病毒感染持续保护力是至关重要的。Trm是一类定居在组织中、不参与淋巴细胞再循环的组织定居型Tm，血液中缺乏该类细胞，因此仅仅检测血液不能真实反映机体T细胞免疫记忆性整体情况。如记忆性Tfh细胞定居在淋巴组织，当再次遇到同一种抗原时，能够迅速分化为活性Tfh，辅助B细胞介导的抗体免疫应答，但是外周血液循环记忆性Tfh细胞却不会显著增加。类似地，组织定居的CD4+或CD8+Trm在外周循环中也无法检测到，但其对于再次抗感染免疫应答中对于靶器官的保护至关重要。因此，仅仅检测外周血无法做到全面评价SARS-CoV-2感染后的T细胞免疫记忆性。但是，通过分析外周血T细胞向这些组织特异性Trm趋化中起关键作用的细胞因子和趋化因子，将会帮助我们间接评价组织特异性Trm产生情况。
(1)外周淋巴组织Trm
SARS-CoV-2记忆性Tfh细胞定居在淋巴组织，当再次遇到同一种抗原时，能够迅速分化为活性Tfh，辅助B细胞介导的抗体免疫应答，但是外周血液循环记忆性Tfh细胞却不会显著增加。Bcl-6通过抑制B淋巴细胞诱导成熟蛋白-1(B lymphocytes induce mature protein-1，Blimp1)促进细胞向Tfh细胞分化。Bcl-6通过直接结合T细胞迁移相关基因的启动子及增强子，抑制这些基因的表达，阻止Tfh细胞迁移出次级淋巴器官，促进其向T-B连接区和淋巴滤泡迁移。IL-21和IL-6能够促进State1/3的表达，进而促进Bcl-6的表达，最终促进Tfh的分化。
(2)肺组织Trm
肺组织Trm的来源：研究证实，SARS-CoV-2感染加重时期的外周血淋巴细胞是减少的。进一步分析发现，一个重要原因可能是T细胞通过趋化因子受体CXCR3被募集到呼吸道感染部位，发挥抗感染免疫应答，在病毒被清除后，部分活化的T细胞就会转变为Trm，定居在呼吸道和肺组织，提供持续的局部免疫保护力。
肺组织Trm的作用：最近一项研究证实在肺组织中存在SARS-CoV-2特异性Trm并持续10个月以上。以往研究亦证实针对SARS-CoV的特异性Trm能够持续6年以上，提示针对SARS-CoV-2存在长寿命Trm。这些Trm既可以定居在呼吸道，也存在肺间质组织，类型为CD4+或CD8+，能长期有效阻止病毒再次感染局部组织。
肺组织Trm特征性表型及功能分子：COVID-19患者恢复期肺组织CD69+和CD69+CD103+Trm显著改变；CD4+和CD8+Trm均显著分泌IFN-γ；CD69+ Trm下调转录因子T-bet，后者与组织免疫记忆性密切相关。最近针对COVID-19患者的深度免疫图谱分析发现，T-bet的表达与较好的预后密切相关。T-bet不仅在抗病毒Th1细胞形成和CXCR3表达中发挥重要作用，与T细胞迁移和增殖也密切相关。目前鉴定出的Trm主要包括针对SARS-CoV-2 N蛋白的CXCR3+CD8+T细胞和IFN-γ+CD107a+CD4+T细胞。类似的，针对流感病毒或结核分枝杆菌感染肺部组织的研究证实，CXCR3-CXCL10轴通过募集CD4+或CD8+T细胞到肺组织发挥重要的原位抗感染保护作用。疫苗免疫接种激活并增加肺Trm将是预防SARS-CoV-2感染的一种重要策略。但是由于目前针对肺组织Trm研究获得的组织样本数量仍然有限，仍需更多样本量的支持。
5．交叉反应性Tm
在病毒感染中还会出现交叉反应性Tm，对新病原体具有的异嗜性抗原产生免疫交叉反应，对新病原的感染做出快速响应。经交叉反应性Tm活化的CD4+或CD8+T细胞，通过分泌IFN-ɑ发挥抗病毒作用。多项研究表明，在健康志愿者中存在针对SARS-CoV-2刺突蛋白的交叉反应性CD4+Tm，可能与以往人类冠状病毒感染有关。研究表明，SARS-CoV-2特异性IFN-γ+CD8+Tm在SARS-CoV-2患者和健康志愿者中的数量相当，提示交叉反应性CD8+Tm在抗SARS-CoV-2感染中亦发挥重要作用。
三、其他细胞的免疫记忆性
固有免疫系统在病毒感染后最先被迅速激活并发挥抗病毒作用，在释放包括干扰素等因子发挥抗病毒作用的同时，主要通过三个方面发挥抗感染作用：(1)有效清除感染细胞并抑制病毒在宿主细胞中的增殖；(2)在局部组织形成抗病毒微环境；(3)活化及维持抗病毒适应性免疫应答的免疫记忆性。前两个方面的作用，有效抑制了病毒的复制与扩散，第三个作用有效地帮助形成持久的免疫记忆性。研究表明，NK细胞在SARS-CoV-2感染中显著增加，甚至在恢复期中也显著升高，提示可能存在记忆性NK细胞。由于近年才发现与认识到固有免疫调控是机体免疫记忆性的重要机制，很大程度上仍需进一步研究。
四、展望