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撰文 赵维杰

审校 黄为人 刘宇辰（深圳大学附属第一医院）

经改造的 CRISPR-Cas9 系统可以实现对特定基因的转录调控。深圳大学研究者 2016年9月5日在线发表于《自然-方法》（Nature Methods）上的一项研究工作对这个系统进行了进一步改造，利用“人工核酸适配体”工具给这个系统装上了“开关”，实现了对该系统的定量调控。

改造后的 CRISPR-Cas9 系统可以在特定信号分子的控制下，完成对下游基因转录的定量调节，达到连通两个原本不相关信号通路的效果。在膀胱癌细胞和裸鼠实验中，该系统可以响应促进肿瘤生长的信号来激活下游抑癌通路，实现对肿瘤细胞的特异性杀伤。

本工作由深圳大学第一附属医院（深圳市第二人民医院）973计划医学合成生物学课题组完成，论文第一作者为刘宇辰博士，共同通讯作者为黄卫人博士和蔡志明教授。

* 点击阅读原文，或复制 http://rdcu.be/j9u8 到浏览器，可阅读由论文作者分享的论文全文（可能需要翻墙）。

背景：经改造的 CRISPR-Cas9 系统可实现转录调控

CRISPR-Cas9 基因编辑系统由 Cas9 蛋白和 gRNA 两部分组成，在 gRNA 的引导下，作为核酸酶的 Cas9 蛋白可以定位于基因组中的特定位点，并完成对基因组的定点切割。

然而，这一系统的功能远不止切割基因：利用生物工程学技术将 Cas9 的核酸切割功能失活后，再将其与能够执行转录调节功能的蛋白质相连接，系统就能在定位于特定位点之后，实现对特定基因的转录激活或转录抑制。

新工作：引入“人工核酸适配体”封锁 gRNA，定量、高效控制 CRISPR-Cas9 系统

上述经改造的 CRISPR-Cas9 系统可以进行转录调节，但是如果没有一个“开关”对其进行控制，其应用范围则大大受限。

本论文共同通讯作者黄卫人博士表示，过去也有一些方法可以对这一系统进行控制，比如影响 Cas9 的表达水平或者生物活性，从而达到调节 CRISPR-Cas9 的目的，然而这些策略的着眼点都在 Cas9 蛋白身上，可供使用的元件有限，灵活性不高，没有实现模块化。和这些方法相比，新的技术将目标锁定在 gRNA，通过 “封锁” gRNA 实现操控 Cas9 的目标，而设计和改造 RNA 要比改造蛋白质更加简单、灵活和高效。这种可控性开关设计，也可能为提高传统 CRIPR-Cas9 系统的安全性作出贡献。

在这项工作中，研究者向系统中引入了人工 RNA 核酸适配体（artificial aptamer），开发了一种高效“分子开关”工具。人工 RNA 核酸适配体是一个已经得到较为深入研究的系统，通过设计特定 RNA 序列来实现对特异性信号分子的识别。在本论文中，研究者创造性地将 gRNA 与“人工”RNA合二为一，借助二者之间的互补配对，屏蔽 gRNA，辅助调控和补足了 CRISPR-Cas9 系统，简便特异地实现“操控” CRISPR-Cas9 系统的目的。

图1 系统原理示意图

在没有信号分子存在的情况下，核酸适配体可以与 gRNA 中负责基因组序列识别的部分互补配对，使整个系统处于关闭状态（图1a，上）。而结合信号分子之后，核酸适配体的结构发生改变，将 gRNA 释放出来，于是失活的 Cas9 就可以找到并结合于特定的基因位点，此结合的发生可以抑制相关基因的转录，实现转录抑制（图1a，下）。而如果在失活的 Cas9 后面连接上一个转录激活因子，这样的结合又可以实现转录激活（图1b）。

应用：促癌信号启动抑癌程序

改造后的系统可以响应来自某个信号通路的信号分子，来调节原本不属于这个信号通路的基因的转录，也就是可以将两个原本不相关的信号通路连接在一起，实现对细胞内信号系统的重塑。

在本论文中，研究者利用这一特性，在肿瘤细胞和裸鼠皮下肿瘤生长实验中，向肿瘤细胞中引入了这一系统，系统感知肿瘤细胞内的原有的促进癌细胞生长的信号，来激活下游的抑癌基因，启动细胞凋亡程序，实现了对肿瘤细胞的特异性杀伤。这项工作的进一步延伸将有可能为癌症精准医疗提供思路。

第一完成人刘宇辰博士答科研圈问

刘宇辰博士

科研圈：论文中提到，改造后的系统可以做到对基因转录调节的“定量可控”，这是怎么做到的？

刘宇辰：定量可控表现在，整套 CRISPR-Cas9 系统对目标基因的转录调控能力直接受到配体浓度的影响，（在一定范围内）配体浓度升高时，系统的转录激活或抑制效率也随之升高。换言之，我们可以通过改变配体的浓度，来定量调节系统的基因调控结果。

科研圈：在这项研究中，这个系统是如何被转载进入靶细胞的？相关的载体方面的现状和发展前景如何？

刘宇辰：在本实验中，整套系统的DNA元件都承载于质粒上，质粒主要通过脂质体介导进入细胞。未来可以开发新的体内基因输送系统，如工程化的大肠杆菌、溶瘤病毒、免疫细胞、纳米颗粒等。目前包括我们实验室在内的，全世界很多地方都在做这些载体的研发工作，主要是为了提高生物安全性和可控性。相信未来这些载体能够用于携带我们开发的“CRISPR signal conductor”，治疗体内实体肿瘤。

科研圈：这个系统的稳定性如何？其他研究组如果现在如果想利用这个工具，好上手吗？

刘宇辰：在完成 gRNA 的序列设计后，需要对不同 gRNA 变异体的调控功能进行测试和筛选。相信做过 riboswitch 工作的实验室，都能够很快将其应用到自己的工作中。

科研圈：CRISPR-Cas9 是一个非常有用的系统平台，您认为这一平台还可能可以被改造出哪些新的功能？

刘宇辰：在过去，这项系统被用于基因敲除、基因敲入、单碱基编辑、转录抑制、转录激活、表观遗传调控、RNA 示踪等。我们课题组则利用 Cas9，进行了逻辑“与”门基因线路构建和信号传导。未来通过不断将其他功能模块（RNA或蛋白）引进该系统，可实现任何新的生物学功能。

*点击阅读原文，或复制 http://rdcu.be/j9u8 到浏览器，可阅读由论文作者分享的论文全文（可能需要翻墙）。

论文基本信息

【题目】 Directing cellular information flow via CRISPR signal conductors.

【作者】 Yuchen Liu, Yonghao Zhan, Zhicong Chen, Anbang He, Jianfa Li, Hanwei Wu, Li Liu, Chengle Zhuang, Junhao Lin, Xiaoqiang Guo, Qiaoxia Zhang, Weiren Huang & Zhiming Cai

【期刊】 Nature Methods

【日期】 Published online 5 September 2016

【doi】  10.1038/nmeth.3994

【摘要】 The complex phenotypes of eukaryotic cells are controlled by decision-making circuits and signaling pathways. A key obstacle to implementing artificial connections in signaling networks has been the lack of synthetic devices for efficient sensing, processing and control of biological signals. By extending sgRNAs to include modified riboswitches that recognize specific signals, we can create CRISPR–Cas9-based ‘signal conductors’ that regulate transcription of endogenous genes in response to external or internal signals of interest. These devices can be used to construct all the basic types of Boolean logic gates that perform logical signal operations in mammalian cells without needing the layering of multiple genetic circuits. They can also be used to rewire cellular signaling events by constructing synthetic links that couple different signaling pathways. Moreover, this approach can be applied to redirect oncogenic signal transduction by controlling simultaneous bidirectional (ON–OFF) gene transcriptions, thus enabling reprogramming of the fate of cancer cells.

【链接】http://nature.com/articles/doi:10.1038/nmeth.3994

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