Science | 有丝分裂之舞——纺锤丝驱动姐妹染色单体分离的结构基础

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在细胞分裂过程中，来源于母细胞的遗传物质需要均等地被分配到子细胞中：纺锤丝作用于动粒 (kinetochore)，从而介导姐妹染色单体分离¹，这一过程大概是每个学过高中生物的人深入骨髓的记忆 (图1)。

图1. 有丝分裂模式图 (图源BioNinja)

动粒作为大型分子机器，可分为内侧着丝粒结合复合物 (centromere-binding complex) 和外侧微管结合复合物 (microtubule-binding complex)，外侧复合物能够通过保守的Knl1-MIND-Ndc80 (KMN) 网络耦联内侧CCAN (constitutive centromere associated network) 与外侧的微管 (图2)。在KMN复合物中，MIND起着连接CACC与Ndc80c和Knl1c的作用，Knl1c在纺锤体组装的检查点中发挥功能²，而Ndc80c (由Ndc80、Nuf2、Spc24和Spc25组成的异源四聚体) 是主要的微管结合组分。

图2. 动粒分子组成示意图¹

外着丝粒与微管之间的结合需要在额外组分的作用下被强化，而这些组分如何协同结合并追踪微管末端，从而避免着丝粒脱离纺锤体，目前仍然未知。在动粒和微管结合的初期，由Aurora B激酶作为纠错 (error correction, EC) 机制³，可以避免错误结合的发生并及时对其进行修正，这意味着动粒和微管的结合并非是双向的。当动粒受张力牵拉时，结合则可以被稳定，纺锤体组装的检查点失活，从而触发有丝分裂后期³。在酵母中，着丝粒中的Aurora B可磷酸化Dam1c，抑制Dam1c环的形成⁴及其与Ndc80c的结合⁵。

为进一步了解Dam1c:Ndc80c在微管组装及纠错机制中发挥的作用，来自MRC的David Barford和Kyle W. Muir共同通讯，于2023年12月8日在Science上发表了一篇题为Structural mechanism of outer kinetochore Dam1-Ndc80 complex assembly on microtubules的科研论文，这项工作解析了酵母外侧动粒^Dam1c:Ndc80c与微管形成的复合物的冷冻电镜结构。研究发现Ndc80c与Dam1c之间存在接触位点，Dam1亚基N端staple区域 (Dam1^Staple) 会与Dam1c环单体之间的互作界面结合。此外，Dam1^Staple和Ndc1c-Dam1c界面上均存在被包埋的EC磷酸化位点，为纠错机制驱动Dam1c环解体和破坏动粒-微管间结合做出了直观的解释。

在样品制备方面，通过逐步添加由紫杉醇稳定的微管、Ndc80c和Dam1c，研究者在冷冻电镜载网上完成了动粒^{Dam1c:Ndc80c-}微管复合物的组装。在采集得到的冷冻电镜照片中，可见饰有Dam1c环 (Dam1c^Ring) 和Ndc80c纤维的微管结构 (图3A)。本文重构得到的Ndc80c和Dam1c亚基分辨率分别为3.5 Å和3.15 Å (图3B-D)，Ndc80c的Spc24:Spc25亚基密度不可见。Ndc80c的coiled coils从微管表面Ndc80和Nuf2亚基CH结构域中延伸，横跨Dam1c^Ring的外表面。为得到完整的复合物模型，研究者将2个动粒^Dam1c:Ndc80c复合物以刚体拟合的形式吻合进本文的密度图中 (图3D)。

图3. 酵母外侧动粒^Dam1c:Ndc80c复合物与微管的相互作用

Dam1c^Ring呈肩并肩结构 (图3C)，亚基间的结合方式与Chaetomium thermophilum 截短的Dam1c^Ring冷冻电镜结构⁶类似。然而，在本文的密度图中，研究者观察到了在C. thermophilum中由于截短而没有被观察到的订书针样的密度 (Dam1c^Staple) (图4A)，该密度将Dam1c^ProtomerA的Dam1、Dad1亚基与Dam1c^ProtomerB的Ask1、Dad4亚基桥接在一起，其与前者的相互作用主要由氢键介导，与后者的相互作用主要由盐桥介导 (图4B)。然而，酵母中进行的验证实验发现Dam1^ΔStaple或Dam1^Staple-mutE(Dam1 Tyr¹⁷、Leu¹⁹、Ile²¹突变为Glu) 都不会影响Dam1c^Ring的组装 (图4C)，提示其中存在其他的代偿机制。此外，Dam1^Staple的Ser20作为Aurora B激酶的作用位点，被埋藏在Dam1c^ProtomerA Dad1亚基Leu³⁹、Asn⁴⁰、Asn⁴³附近的亚基间界面上，其磷酸化会通过产生空间位阻和电荷相斥，从而阻断Dam1^Staple的结合 (图4B)。

图4. Dam1的N端对Dam1c^Ring的组装起稳定作用

Ndc80c的微管结合结构域呈棒球状，由两个CH结构域组成 (图5A),其底部与α/β tubulin界面沿原纤维侧向轴结合，Ndc80:Nuf2的coiled coil结构垂直于CH结构域向外伸出。鉴于Ndc80 N端密度不可见，其如何参与动粒-微管的连接尚不可知。此外，Ndc80c:Nuf2 coiled coil结构的基部有一团额外的密度，交联质谱和突变实验提示该区域能够与Dam1 C端相互作用。结合AlphaFold2预测结果，可发现Dam1 C端的两个短片段 (Dam1^C-ter) 与Ndc80c^CH结构域的相互作用 (图5B)。利用酵母进行的功能验证提示这一界面的完整性对于动粒功能的发挥及酵母的生存至关重要。

图5. Ndc80c与微管的相互作用以及Ndc80c^CH与Dam1之间的互作界面

Ndc80:Nuf2中央的coiled coil与Dam1c^Protomer界面附近一对来自Spc34的β strand存在相互作用，此处的β strand上含有EC的靶氨基酸残基Thr¹⁹⁹ (图6E, F)。与前期交联质谱及突变实验结果一致，在结构中，Ndc80:Nuf2 coiled coil的中央段靠近保守Ndc80环的区域直接与Spc34:Spc19的C端发生相互作用。在酵母中进行功能验证时，发现在该界面上突变Ndc80的一系列残基 (Ndc80^CC-mut1及Ndc80^CC-mut2) 都不会影响动粒功能的发挥以及酵母的生存，此外，该界面的完整性也并不能确保外侧动粒功能的正常发挥。

图6. Ndc80:Nuf2与Spc34之间的相互作用

为了进一步分析结构中每个互作界面对外侧动粒^Dam1c:Ndc80c复合物受力的贡献，研究者进一步纯化了一系列Dam1c和Ndc80c突变体，并进行力断裂试验 (force-rupture assay) (图7A, B)。与单独的Ndc80c相比，动粒^Dam1c:Ndc80c复合物可以承受更大的力，而Dam1^C-ter和Dam1^Staple的突变会导致所能承受的力减小。本研究的结构和生化数据表面，对Dam1这些功能元件的破坏，会导致Dam1C^Ring无法形成、无法与Ndc80c相互接触，进而导致受力能力的降低。在酵母中，当Dam1^C-ter的关键残基被突变为Ala (Dam1^C-ter-mutA) 时，酵母尚存较弱的生长能力，然而Dam1^Staple的删除或突变 (Dam1^ΔStaple和Dam1^Staple-mutE) 会导致其生长被完全抑制 (图7C)。本文结构中鉴定的界面上的突变很可能导致细胞动粒-微管互作发生缺陷，导致其无法支持正常的染色体分离。

图7. 复合物受力分析

综上，研究者进一步整合了过去的结构研究和体内动粒亚基相对位置及化学计量比的测量结果，提出了酵母动粒与微管结合的完整模型 (图8)。在这一模型中，内侧动粒与微管间存在8个Ndc80c连接，这些Ndc80c分子可以很好的适应Dam1c^Ring上16个结合位点。Ndc80c^CH和Ndc80Loop之间柔性的铰链区使得Ndc80复合物可以在Dam1c^Ring上折叠呈钩状，从而解释Ndc80c:Nuf2 coiled coil结构如何以平行的方式对接在Spc19:Spc34上。

图8. 本文提出的动粒-微管完整互作模型

供稿 | 王彤彤

审稿 | 丛野

责编 | 囡囡

排版 | 可洲

微信号：FRCBS-THU

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原文链接

参考文献

参考文献

1. A. D. McAinsh, A. L. Marston, The Four Causes: The Functional Architecture of Centromeres and Kinetochores. Annu. Rev. Genet.56, 279–314 (2022).

2.E. S. Fischer, Kinetochore-catalyzed MCC formation: A structural perspective. IUBMB Life75, 289–310 (2023).

3.S. Hauf, R. W. Cole, S. LaTerra, C. Zimmer, G. Schnapp, R. Walter, A. Heckel, J. van Meel, C. L. Rieder, J. M. Peters, The small molecule Hesperadin reveals a role for Aurora B in correcting kinetochore–microtubule attachment and in maintaining the spindle assembly checkpoint. J. Cell Biol.161, 281–294 (2003).

4. A. Zelter, M. Bonomi, J. O. Kim, N. T. Umbreit, M. R. Hoopmann, R. Johnson, M. Riffle, D. Jaschob, M. J. MacCoss, R. L. Moritz, T. N. Davis, The molecular architecture of the Dam1 kinetochore complex is defined by cross-linking based structural modelling. Nat. Commun.6, 8673 (2015).

5.H. Doodhi, T. Kasciukovic, L. Clayton, T. U. Tanaka, Aurora B switches relative strength of kinetochore-microtubule attachment modes for error correction. J. Cell Biol.220, e202011117 (2021).

6.S. Jenni, S. C. Harrison, Structure of the DASH/Dam1 complex shows its role at the yeast kinetochore-microtubule interface. Science360, 552–558 (2018).

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