Nature | 靶向Nav1.7治疗骨关节炎——镇痛的新思路

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骨关节炎作为一种退行性的关节疾病，会导致关节功能逐渐丧失，最终致患者残疾¹。在这一疾病发生发展的过程中，软骨细胞会经历一系列复杂的变化，其中涉及合成和分解等代谢方面的改变²。

除了关节软骨的损伤，疼痛是骨关节炎最主要的临床症状³。关节的滑膜和软骨下骨组织中含有丰富的外周感觉神经元，这些神经元能够特定表达一些电压门控钠离子通道 (voltage-gated sodium channel, VGSC)，即Na_v1.1-Na_v1.9，其中，Na_v1.7-1.9由于其在脊髓背根神经节 (dorsal root ganglia, DRG) 神经元中的高表达及其在外周痛觉通路动作电位起始和传播中的作用而备受关注⁴。过去的研究发现，在MIA (monosodium iodoacetate) 诱导的骨关节炎大鼠模型中，选择性抑制Na_v1.7和Na_v1.8可以有效减轻疾病带来的疼痛⁵。

通常，VGSC被认为主要表达于兴奋性细胞，然而，近年来许多研究揭示了其在星形胶质细胞、巨噬细胞和癌细胞等非兴奋性细胞中的表达⁶。此外，早期针对兔软骨细胞的电生理分析提示软骨细胞中可能有VGSC的存在⁷。

2024年1月3日，来自纽约大学的刘传聚和来自耶鲁大学的Stephen G. Waxman共同通讯，在Nature上在线发表了一篇题为"Na_v1.7 as a chondrocyte regulator and therapeutic target for osteoarthritis"的科研论文。本文发现在Na_v1.7可在人软骨细胞中表达，并在骨关节炎的发生发展中起到重要的作用，特异性阻断Na_v1.7或可作为未来治疗骨关节炎的一种策略。此外，通过分泌组分析，研究者还尝试解答了抑制Na_v1.7所产生的保护作用的可能机制。

在人软骨细胞中，SCN2A、SCN3A、SCN4A、SCN8A、SCN9A和SCN11A均有表达，相比于正常软骨细胞，在骨关节软骨中，Na_v1.7 (SCN9A编码) 的转录本存在显著上调趋势，且该现象在RT-qPCR和免疫组织化学染色上均得到了进一步证实。此外，研究者还在来自3名骨关节炎患者的77个软骨细胞中对Na_v1.7的电流进行了检测。在1 μM TTX (能阻断除Na_v1.5、Na_v1.8和Na_v1.9之外所有的Na_v通道) 存在的情况下，由-90 mV逐渐施加测试电压到-60mV~50mV，并对相应电压下的TTX敏感型 (TTX-sensitive, TTX-S) 电流 (TTX存在时的电流减去control溶液中的电流) 进行检测，发现与Na_v1.7主导的电流相似，TTX-S电流在-40 mV时开始激活，并在0 mV表现出最大峰值幅度和钠反转电位 (图1)。

图1. 人软骨细胞TTX-S电流

为进一步证实Na_v1.7参与TTX-S电流的产生，研究者对ProTx II (选择性Na_v1.7阻断剂) 敏感型 (ProTx II-S) 电流进行检测，并与TTX-S电流进行比对 (图2)，证实TTX-S电流主要由Na_v1.7产生。在膜片钳记录的结果中，表达Na_v1.7的细胞占77个软骨细胞中的17%,这些细胞中0 mV测试电位的平均内向电流幅度为82±19 pA（n=13），平均电流密度为2.4±0.4 pA pF⁻¹（n=13）。

图2. 人软骨细胞ProTx II-S电流

为了进一步探究Na_v1.7在关节炎软骨细胞中的作用，并对DRG和软骨细胞中表达的Na_v1.7在关节炎发展和疼痛发生中的贡献，研究者构建了Na_v1.7 DRG特异性敲除 (Na_v1.7^DRG) 的小鼠、Na_v1.7 软骨细胞特异性敲除 (Na_v1.7^chondrocyte) 的小鼠以及DRG和软骨细胞Na_v1.7均被敲除 (Na_v1.7^{DRG;chondrocyte}) 的小鼠。在手术诱导和化学诱导的两种骨关节炎模型中，组织学染色均发现Na_v1.7的缺失会减轻软骨的损失。此外，手术诱导模型中，Na_v1.7^chondrocyte小鼠骨赘形成减少，软骨下骨板增厚现象减轻，而这两者在关节炎发生时意味着硬化的发生(图3)。在行为学实验中，Na_v1.7缺失的小鼠表现出更大的运动总距离，且机械性触痛程度较低（图3）。

图3. DRG及软骨Na_v1.7的敲除可以减缓疾病发展、减轻疼痛

与在Na_v1.7^{DRG;chondrocyte} DMM小鼠中观察到的结果相似，手术诱导的Na_v1.7^chondrocyte小鼠也存在明显减少的软骨丢失，骨赘形成减少，软骨下骨板增厚减轻，滑膜炎评分降低，小鼠表现出旷场运动活动增加及机械性触痛的丧失 (图4)。而在Na_v1.7^DRG小鼠中，虽然小鼠表现出疼痛的减轻，但是软骨破坏等一系列组织学水平的变化仍然存在。综上，研究者认为，软骨细胞中表达的Na_v1.7对骨关节炎的进展和相关的疼痛均存在调节作用，而DRG中的Na_v1.7与疼痛相关，不参与疾病本身的进展。

图4. 软骨中Na_v1.7的敲除即可减少软骨损失并减轻疼痛

那么，如果使用Na_v1.7选择性阻断剂是否能够抑制软骨破坏并缓解疼痛呢？在手术诱导的骨关节炎小鼠模型中，研究者向其关节内隔天注射PF-04856264，通过Safranin O染色 (能对软骨进行染色)，发现Na_v1.7的抑制对关节软骨具有保护作用，小鼠关节软骨的损伤明显减轻，此外，进一步研究发现，该抑制剂的口服全身性给药也可以发挥相应的效果。

卡马西平 (Carbamazepine,CBZ) 作为一种已被FDA批准用于癫痫、躁郁症和神经病疼痛治疗的钠通道阻断剂，能够作用于Na_v1.7。在化学诱导的骨关节炎小鼠模型中，CBZ口服给药可以实现与PF-04856264相似的效果 (图5)。

图5. 卡马西平抑制Na_v1.7具有潜在的治疗作用

在前述的研究结果中，Na_v1.7的阻断看似对软骨细胞存在促合成、抗分解的作用。在进一步的体外实验中，研究者发现TTX、ProTx II和PF-04856264等具有Na_v1.7抑制作用的分子，均会对IL-1β诱导的、参与分解代谢的蛋白表达发挥抑制作用 (如MMP13、ADAMTS5、COX2和NOS2等)。在来源于6名膝关节骨关节炎患者的原代软骨细胞中，ProTx II和PF-04856264对分解代谢的作用进一步得到了证实。在人关节炎软骨组织中 (来自于接受全膝关节成形术的骨关节炎患者)，可观察到软骨分解标志物MMP13的水平显著降低。

鉴于膜电位对细胞生物学功能的影响，研究者猜测蛋白的分泌或跨膜转运可能参与了Na_v1.7抑制所引起的软骨细胞生物学的变化。研究者收集了PF-04856264或ProTx II处理后软骨细胞的培养基，并发现用这些培养基孵育细胞，会产生与Na_v1.7抑制类似的作用，提示Na_v1.7抑制后细胞所分泌的成分与软骨细胞的细胞生物学变化存在一定的相关性。进一步对培养基中不同分子量的物质进行分析，发现30-100 kDa的成分能够在不影响细胞分解代谢的情况下促进合成，而10-30 kDa的成分会抑制细胞因子诱导的分解代谢。结合串联质谱分析，研究者将目光进一步锁定HSP70和midkine，除了分子水平和细胞水平的验证之外，研究者还发现在小鼠模型中，这两种蛋白的抑制会显著降低Na_v1.7抑制所带来的软骨保护作用(图6)。

图6.HSP70和midkine发挥软骨保护作用

研究者认为，Ca²⁺作为调节蛋白分泌的第二信使，可能在Na_v1.7下游发挥作用。通过一系列详实的细胞水平的验证，研究者发现Na_v1.7的抑制在早期减少了ATP刺激的胞内钙的增加，但随后又出现钙水平的升高，后者由细胞膜上的钠钙交换体 (sodium-calcium exchanger, NCX) 介导 (图7)。

图7. Na_v1.7抑制后产生软骨保护作用的机制

由于Na_v1.7在中枢神经系统中的分布，在作为镇痛药物研发的靶点时，其潜在的中枢副作用常常是研究者十分关心的问题。在本研究中，研究者发现Na_v1.7可表达于人关节软骨，同时在小鼠骨关节炎模型中，抑制软骨中的Na_v1.7可以在很大程度上减缓疾病的发展，同时缓解疼痛。这一系列发现，或许可以为靶向Na_v1.7的离子通道阻断剂提供新的使用思路，在规避其中枢副作用的同时，最大程度的实现镇痛效果。

供稿 | 王彤彤

审稿 | 丛野

责编 | 囡囡

设计 / 排版 | 可洲 王婧曈

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参考文献

参考文献

1.  Loeser, R. F. et al. Microarray analysis reveals age-related differences in gene expression during the development of osteoarthritis in mice. Arthritis Rheum. 64, 705–717 (2012).

2. Abramson, S. B., Attur, M. & Yazici, Y. Prospects for disease modification in osteoarthritis. Nat. Clin. Pract. Rheumatol. 2, 304–312 (2006).

3. Fu, K., Robbins, S. R. & McDougall, J. J. Osteoarthritis: the genesis of pain. Rheumatology 57, iv43–iv50 (2018).

4. Dib-Hajj, S. D., Cummins, T. R., Black, J. A. & Waxman, S. G. Sodium channels in normal and pathological pain. Annu. Rev. Neurosci. 33, 325–347 (2010)

5. Rahman, W. & Dickenson, A. H. Osteoarthritis-dependent changes in antinociceptive action of Nav1.7 and Nav1.8 sodium channel blockers: An in vivo electrophysiological study in the rat. Neuroscience 295, 103–116 (2015).

6. Black, J. A. & Waxman, S. G. Noncanonical roles of voltage-gated sodium channels. Neuron 80, 280–291 (2013).

7. Malfait, A. M. & Miller, R. J. Emerging targets for the management of osteoarthritis pain. Curr. Osteoporos. Rep. 14, 260–268 (2016)

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