Nature｜结构优化助力开发肾脏友好的抗真菌药物

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两性霉素B（AmB）是一种抗真菌药物，其通过形成海绵状聚集体从脂质双分子层中提取麦角甾醇（Erg）来杀死真菌^1,2。但AmB的一种与胆固醇（Chol）结合但非膜渗透性的变异体C35MeOAmB能够抽提胆固醇，具有对原代人肾细胞的毒性³。因此开发肾脏友好的多烯抗真菌药物成为当前的研究难点。

2023年11月8日，伊利诺伊大学香槟分校Martin Burke和威斯康星大学麦迪逊分校Chad M. Rienstra教授团队在Nature上发表了题为“Tuning sterol extraction kinetics yields a renal-sparing polyene antifungal”的研究性论文。该研究通过快速且选择性地提取真菌中的麦角甾醇，并通过结构改造开发出既高效又对肾脏损害较小的多烯类化合物AM-2-19。该化合物在小鼠和原代人肾细胞中对肾脏的损害较小，对数百种致病真菌菌株具有强大的抑制活性，并且在动物模型中对于侵袭性真菌感染具有极高的疗效。

为了开发能够选择性结合Erg而不是 Chol的抗真菌药物，作者试图从结构上表征AmB-Erg与AmB-Chol海绵样复合物。作者首先制备了AmB-甾醇复合物，并用高分辨率的固态核磁共振(SSNMR)光谱测定。Erg滴定后，¹³C[AmB]的二维光谱显示其从两种状态转移到单一状态（图1c）。甾醇滴定过程中，SSNMR光谱的变化以及UV-可见光谱信号的变化均在AmB/甾醇比例为1:2时达到饱和（图1c, g）。为了获得甾醇结合复合物的结构，作者使用Xplor-NIH模拟退火计算，结果表明在靠近C11-C20区域的位置AmB分子形成一种类似笼状晶格的结构将 Erg包裹（图1a, e）。¹H-¹³C自旋扩散实验进一步揭示了与均质化的AmB相比，饱和甾醇样品中多烯脱水和C13/C1’信号与这些位点上的甾醇结合相一致（图1f）。AmB-Chol复合物的紫外-可见光谱的甾醇滴定实验（图1g，h）、甾醇结合的¹³C-¹³C光谱（图1d）以及甾醇洗脱的实验结果都与AmB与Erg结合时的结果类似 ，表明AmB在与两种甾醇结合时采取了极为相似的晶格构象。

图1. AmB甾醇海绵样复合物以相似的方式包裹类固醇和胆固醇

等温量热(ITC)实验表明AmB对Erg的亲和力高于Chol（图2c）。因此，作者推测这些复合物的受控失稳或许可以消除不太有利的Chol结合，同时保留足够的结合Erg的能力（图2b）。为了确定选择性破坏甾醇络合的目标结构特征，作者将AmB甾醇结合复合物与apo-AmB结构进行了比较，两种结构的高阶晶格组织不同，在甾醇结合复合物中可以观察到更大的AmB最近邻距离（图2a）。进一步地作者根据结构推测涉及C2' - OH的相互作用可以通过C2'立体中心的异构化而被破坏，从而导致甾醇结合的笼形物的可控不稳定，同时维持糖基化多聚烯大环内酯的稳定性。于是作者通过11步合成了C2'前位异构体（C2′epiAmB），ITC实验表明其与Chol没有结合，与Erg的结合能力有所减弱（图2c）。这与紫外-可见光谱的甾醇结合试验结果相一致(图2d, e)。与AmB相比，缺乏Chol结合使C2'epiAmB对人原代肾细胞等多种细胞的毒性显著降低，即使剂量 ≥ 45mg/kg也不会引起肾脏生物标志物的升高或肾脏组织病理学的变化（图2g, h）。与此同时作者还通过体内与体外实验表明C2′epiAmB与AmB相比结合Erg的能力确实下降了（图2i），并且效力的下降在不同病原体中有差别，但其仍然能够通过相同的固醇海绵机制杀死真菌。

图2. AmB -甾醇复合物的可控不稳定导致对Erg的选择性

考虑到保留的甾醇提取机制和病原体依赖性的效力变化，作者推测C2'epiAmB可能比AmB提取Erg的速度更慢，从而在不同的病原体菌株中发生Erg生物合成与提取的竞争（图3a）。对Erg提取率和杀伤动力学的评估证实，C2'epiAmB提取Erg和杀死真菌的速度比AmB慢，而与Erg生物合成抑制剂酮康唑共同给药时能够使其恢复到AmB的杀伤效力（图3b, c）。接下来作者试图将将AmB C16位置的羧酸转化为非电离官能团从而选择性地提高Erg提取动力学。结果发现一系列AmB-c16酰胺与AmB相比Erg提取速度和杀灭动力学都更快，并且杀菌效力的增加并没有伴随着对Erg结合能力的增加（图3d-f）。其中AM-243-2由于保留了对Chol的结合因此对人体细胞有毒（图3g）。作者将C2'外显异构化与最具促效性的丝氨酸醇侧链配对，形成了AM-2-19（图3h）。AM-2-19与Erg结合但不与Chol结合，对人体细胞无毒，并且比C2'epiAmB更快地提取Erg，更快地杀死真菌（图3g-j）。

图3. Erg提取动力学对抗真菌效果的调控

为了保持稳定以及和血浆相容的水溶液，作者将AM-2-19与DP2K按比例混合制成AM-2-19_DP2K，并进行了一系列体内实验，以评估其耐受性和疗效。在健康雌性CD-1小鼠中，高达45 mg/kg剂量的AM-2-19_DP2K几乎没有引起临床生物标志物升高或肾脏组织病理学变化（图4a）。作者还测试了AM-2-19_DP2K和其他临床抗真菌药物对500多种不同病原真菌菌株的抗真菌活性，AM-2-19_DP2K的效力以及病原菌覆盖范围都相当或超过AmBisome等药物（图4b）。念珠菌病、传播性和肺部曲霉感染以及毛霉病小鼠模型中AM-2-19_DP2K都能有效清除真菌感染（图4c-h）。

图4. AM-2-19_DP2K的体内耐受性和疗效

综上所述，该研究深入了解了两性霉素B杀死真菌和人类细胞的机制，并通过选择性调整甾醇提取动力学产生一种新的多烯抗真菌药物。这种药物既能保护肾脏，又能在临床相关的侵袭性真菌感染动物模型中发挥高效作用，从而为改进真菌感染的治疗提供了新的可能性。

供稿 | 娄鑫垚

审稿 | 丛野

责编 | 囡囡

设计 / 排版 | 可洲  雨萱

微信号：FRCBS-THU

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参考文献

参考文献

1.Gray, K. C. et al. Amphotericin primarily kills yeast by simply binding ergosterol. Proc. Natl Acad. Sci. USA 109, 2234–2239 (2012).

2. Revie, N. M. & Cowen, L. E. Glycosylated polyene macrolides kill fungi via a conserved sterol sponge mechanism of action. ACS Cent. Sci. 7, 706–708 (2021).

3.Maji, A. et al. Tuning sterol extraction kinetics yields a renal-sparing polyene antifungal. Nature 623, 1079–1085 (2023).

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