撰文| 高世龙

责编| 丁霄哲

编辑| 陈欣泓 石悦琳

图片来源：eLife. http://lens.elifesciences.org/14721

2018年诺贝尔奖生理学或医学奖颁给了癌症免疫疗法的两位突出贡献者James P. Allison和Tasuku Honjo。近年来随着癌症免疫疗法的兴起，有些癌症已经不再是不治之症，而业界更是普遍看好免疫疗法在肿瘤治疗中的发展前景。基于能够特异识别并杀伤肿瘤的T细胞的免疫疗法预示着个性化医疗新时代的到来，为癌症患者的治疗带来希望。现有研究结果证实，T细胞介导的免疫反应可以消灭癌细胞，并具有良好的预后效果。目前基于T细胞的免疫疗法主要包括通过抑制免疫检查点PD-1来激活内源T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用；还有通过嵌合抗原受体（CAR）或T细胞受体（TCR）为基础的肿瘤靶向性T细胞疗法。

细胞靶向的嵌合抗原受体（CAR）或T细胞受体（TCR）T细胞疗法

图片来源：

http://www.jimmunol.org/content/195/3/755

在T细胞介导的免疫疗法中，T细胞对特定肿瘤细胞的精确识别至关重要。经典的CAR由胞外抗原结合区、跨膜区域和胞内信号转导区组成。CAR-T细胞利用由单克隆抗体轻链和重链组成的单链，非MHC（主要组织相容性复合物）依赖性地识别肿瘤细胞的表面抗原。于此不同的是，TCR-T疗法的靶标受MHC限制。TCR能精确的识别肿瘤细胞的特定MHC分子所呈现的抗原。

这些肿瘤源性抗原通常是肿瘤胞内蛋白被蛋白酶体降解成肽段，再被MHC呈现到细胞周表面，而T细胞通过TCR识别这些肽段来判断这些细胞是否正常。就好像警察在路上查证件一样，病变细胞的“证件”上的”照片“自然跟其他人的不太一样。通过向T细胞转入靶向特异性识别肿瘤抗原的TCR基因，使得这些携带肿瘤特异性TCR的T细胞（TCR-T），就好像手持印了照片的通缉令，可以高效地识别并特异性地杀死这些肿瘤细胞。癌症TCR-T免疫疗法的一大关键，就是找到能够针对病人体内肿瘤细胞的抗原的TCR（也就是为病人体内的肿瘤细胞找到合适的通缉令照片）。

TCRs和CARs通过不同的机制识别肿瘤细胞

图片来源：

http://clincancerres.aacrjournals.org/content/22/7/1559

先前大家主要是用某一特定的抗原来筛选识别该抗原的TCR。 但是我们目前知道的肿瘤特异性的抗原很少，而且一直以来没有好的方法来发现它们。外显子组测序（exome-sequencing）和质谱分析（mass spectroscopy）技术给我们提供了更多潜在肿瘤抗原的选择。依赖于外显子组测序的抗原-TCR鉴定方法主要针对高突变的肿瘤，比如黑色素瘤，然而对于低突变的前列腺癌，依赖于外显子组测序则不可行。利用质谱分析则可以获得大量呈现在肿瘤细胞表面的抗原肽段，但需要大量的肿瘤组织来达到检测量的需求并且技术上也有很大的难度。这两种方法本质上都是用抗原来筛选TCR，在确定抗原肽段后主要依靠在体外利用相应的抗原递呈细胞激活并扩增能特异性识别该抗原的T细胞，或者通过制备特异性的pMHC多聚体来筛选识别该抗原的T细胞。但是由于肽段的合成以及pMHC多聚体制备的局限性，使得无法在技术上实现无偏见的快速，高通量的筛选。高通量单细胞测序技术的飞速进展，使得我们很容易从血液或组织样本中得到千对以上的TCR双链配对序列。然而，仅仅从TCR的序列并不能预测这些TCR的抗原特异性，这极大阻碍了我们对肿瘤T细胞免疫应答的深入研究，同时也限制了这些孤儿TCRs在临床上的应用。因此，在基础研究和转化医学的研究中，都迫切要求我们开发出与单细胞TCR测序技术相匹配的TCR配体发现技术。结合单细胞TCR和mRNA测序的结果，研究人员可以鉴定出具有一系列可能具有肿瘤杀伤性的TCRs。从这些孤儿TCRs筛选其识别的抗原，就好像用已知的钥匙找锁，而不是用大量的锁去试每把钥匙。但现有的酵母文库筛选的方法对于每个孤儿TCR都要制备相应的荧光标记的可溶性TCR，而成功制备所有这些可溶性TCRs具有极大的难度并需要较长的周期，从而不能实现快速、高通量的筛选。

早在上个世纪70年代，研究者们就发现T细胞表面会带有其他抗原递呈细胞(APC）的MHC蛋白分子和其他蛋白分子。原来T细胞和抗原递呈细胞在形成免疫突触（immunological synpase）时会提取其表面的其他分子，后来研究者发现这一过程是双向的：抗原递呈细胞也会提取T细胞表面的蛋白分子，比如TCR。这种交换的结果，就是抗原递呈细胞的表面会留下和T细胞接触过的痕迹。研究者将其称为胞啃作用。李贵登博士和Baltimore实验室的其他研究者们正是利用了这一原理，通过检测抗原递呈细胞表面上是否存在从T细胞转移过来的TCR，就可以确定这些细胞的MHC分子是否可以与靶标TCR分子特异配对。

胞啃作用具有非常高的特异性（high specificity），只会在TCR-抗原成功识别的细胞之间发生。

图片来源：参考文献 1

李贵登博士将表达已知配对的TCR Jurkat T细胞投入到以1/10000比例混有其特异识别的pMHC分子的APC细胞的混合物当中，通过流式细胞术检测发现，胞啃作用能准确的标记70%以上的与这个TCR特异配对的APC细胞，而其他没有发生识别的抗原递呈细胞则不会被标记。不仅如此，在一个包括所有实验验证过可以被HLA-A2 MHC分子所递呈的肽段的细胞库中，利用两个在临床使用过的已知配对TCRs同样证实这些表达特定TCR 的T细胞依旧可以非常特异的在众多表达不同抗原的递呈细胞中精确标记发生过识别的抗原递呈细胞。

在肿瘤的发生发展过程中，肿瘤细胞会累积基因突变并产生异常蛋白质，这些蛋白质，很有可能会激活免疫系统，并引来免疫系统对癌细胞的攻击。基因组学，蛋白质组学以及生物信息学的高速发展，让研究者可以从癌症患者的肿瘤中快速的鉴定出这些能够被由癌细胞基因突变所产生的异常蛋白质（异常抗原），就是肿瘤新生抗原（Neoantigen）。由于这新生抗原具有肿瘤特异性，因此靶向这些抗原的免疫治疗在精准医学中具有巨大的应用潜力。通过对黑色素瘤患者癌组织全外显子基因测序，结合对人类白细胞抗原（HLA）表位结合亲和力的预测，他们建立了一个该患者特有的新生抗原肽段的文库。李博士他们进一步从黑色素瘤病人肿瘤中分离出浸润的淋巴细胞（TIL），并利用克隆出来的孤儿TCR成功验证了基于胞啃作用的TCR-抗原配对筛选平台在个性化医疗中高效筛选新生抗原特异性TCR的可行性。

图片来源：参考文献 1

总的来说，本研究独创性的开发了一种快速，简单并具有高精确度的TCR-抗原配对筛选平台。 这个平台可以用来筛选任意HLA类型的TCR所识别的抗原。这种技术不仅仅可以用来筛选被MHCI所呈现的抗原-TCR配对，也可以应用于MHCII所呈现的抗原-TCR配对，从而用来鉴定除了肿瘤之外与其他的免疫疗法相关的潜在抗原，比如那些自身免疫疾病抗原。未来，科学家们有望利用这项技术，针对这些新鉴定靶点，开发癌症疫苗让人体对癌细胞产生免疫力或者开发TCR-T细胞免疫治疗。

值得一提的是，同期Nature Methods还报道了来自Baltimore lab的另一篇题为T cell antigen discovery via signaling and antigen-presenting bifunctional receptors的文章，介绍了基于另一种原理的筛选TCR抗原的技术，李贵登博士也是该文章作者之一。

李贵登博士将于2019年全职加入中国医学科学院-北京协和医学院, 苏州系统医学研究所，并将继续致力于肿瘤微环境免疫调控，T细胞受体和T细胞免疫治疗相关的研究。目前该课题组正在招聘助理/副研究员、博士后和科研助理若干名。希望有兴趣的同学加盟。课题组网址：

http://www.ismsz.cn/Index/Page/eb147284-0db2-4958-a8dc-6c752d530304（或点击“阅读原文”即可直接查看）。

参考文献

1.  Li, G. et al. T cell antigen discovery via trigocytosis. Nature Methods. 16, 182-190

2. Joglekar, A. et al. T cell antigen discovery via signaling and antigen-presenting bifunctional receptors. Nature Methods. 16, 191-198

3. Bethune, M. T. & Joglekar, A. V.Personalized T cell-mediated cancer immunotherapy: progress and challenges. Curr.Opin. Biotechnol. 48, 142–152 (2017).

4.  Gee, M. H. et al. Antigen identification for orphan T cell receptors expressed on tumor-infiltrating lymphocytes. Cell172, 549–563 (2018).

5.  Schumacher, T. N. & Schreiber, R. D.Neoantigens in cancer immunotherapy. Science 348, 69–74 (2015).

6.  Bentzen, A. K. et al. Large-scale detection of antigen-specific T cells using peptide-MHC-I multimers labeled with DNA barcodes. Nat. Biotechnol. 34, 1037–1045 (2016).

7. Bassani-Sternberg, M. & Coukos, G. Mass spectrometry-based antigen discovery for cancer immunotherapy. Curr. Opin. Immunol. 41, 9–17 (2016).

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